人源天然Fab噬菌體抗體庫的構建及抗c-Met抗體的篩選、鑒定.pdf

1、上世紀80年代，met作為原癌基因被首次發(fā)現。其表達產物c-Met是一類酪氨酸激酶受體，唯一的配體是肝細胞生長因子/擴散因子(HGF/SF)。c-Met在大多數實體腫瘤以及白血病均明顯高表達，且與腫瘤臨床預后不良高度相關。HGF/SF、c-Met在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移過程中起關鍵作用，可促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和腫瘤血管生成。c-Met也因此成為抗腫瘤治療的重要靶點。目前已開展的針對HGF/SF和c-Met的腫瘤治療包括，反義核酸分子、

2、小分子RNA、HGF/SF拮抗劑NK4、c-Met抑制劑sU11274等，以及抗c-Met或抗HGF/SF的抗體等。 抗體由于其對相應靶抗原具有高度的特異性并能偶聯其它抗腫瘤藥物結合到靶抗原分子而成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。在臨床治療中，人抗鼠抗體反應(HAMA)等缺點影響了鼠源性單抗的應用，因此研制全人源抗體成為重要的發(fā)展方向。噬菌體抗體庫技術是制備全人源抗體的主要技術平臺。大容量、具有良好多樣性的抗體庫，是獲得各種人源抗體的有

3、效途徑，而且對獲得高親和力抗體以及在對抗體性能進行改造方面具有較強的優(yōu)勢。本文應用噬菌體抗體庫技術，克隆出全套人抗體基因，并在噬茵體表面表達，構建大容量人源天然Fab抗體庫，從中篩選出特異性抗c-Met全人源Fab抗體片段，為抗腫瘤藥物的研制提供新的候選分子。 研究方法 1.取20位健康成人骨髓分離后的淋巴細胞，抽提總RNA，反轉錄成cDNA。以25對人源抗體基因引物擴增抗體可變區(qū)基因；從兩個重組載體pComb3XTT和

4、pComb3Xλ將重鏈CH1、輕鏈恒定區(qū)CL基因分別擴出。再經2輪Overlap-PCR連接得Fab基因。Fab基因和pComb3XSS載體各經SfiⅠ酶切后，進行二者連接。通過多次電轉化導入E.coli.XL1-Blue菌，得到人源天然Fab噬菌體抗體庫。 2. 以固相化蛋白對抗體庫進行6輪篩選，隨機挑選60個克隆用Phage ELISA進行鑒定。陽性者經Bst0Ⅰ酶切片段分析為不同克隆的，行測序分析，并轉化入E.coli.T