TAT-CT-1，TAT-EGFP融合蛋白的表達(dá)，純化及其在小鼠體內(nèi)分布的初步觀察.pdf

1、當(dāng)今社會(huì)，脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)呈現(xiàn)出高發(fā)生率、高致殘率、高耗費(fèi)、低死亡率、青壯年患者居多的特點(diǎn)，加強(qiáng)SCI救治有十分重要的意義。而其中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在SCI后明顯促進(jìn)神經(jīng)元的存活，并上調(diào)再生相關(guān)基因。 心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是1995年由Pennica等發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，由203個(gè)氨基酸組成，能夠刺激體外新生大鼠心肌的生長(zhǎng)，與睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliaryn

2、eurotrophicfactor，CNTF)同屬于IL-6家族。由于與CNTF的同源性，CT-1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用越來(lái)越引起人們的注意。CT-1能長(zhǎng)時(shí)間的支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括脊髓和腦運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)、多巴胺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活。已報(bào)道CT-1基因治療大鼠進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、脊髓側(cè)束硬化(acutelateralsclerosis，ALS)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并取得較好的效果。張正豐等克隆了人CT-1基因、原核表達(dá)并純化了重組CT-1蛋白、構(gòu)建了

3、人CT-1重組腺病毒載體，并用于神經(jīng)損傷方面的研究；在周圍神經(jīng)損傷方面，將純化的重組CT-1蛋白置于成年大鼠坐骨神經(jīng)切斷后橋接的硅膠管，發(fā)現(xiàn)重組CT-1蛋白促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。 但是，由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子無(wú)法通過(guò)血腦屏障且半衰期短，CT-1等可溶性生物大分子物質(zhì)很難通過(guò)血腦屏障，從而限制了CT-1的應(yīng)用及給藥方式。因此，向脊髓損傷區(qū)域提供高效特異的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)因子對(duì)脊髓傳導(dǎo)束的保護(hù)和再生一直是SCI及其修復(fù)的

4、研究熱點(diǎn)。而長(zhǎng)期、反復(fù)和方便的給藥方式也是SCI研究的技術(shù)難點(diǎn)。 人類免疫缺陷病毒-1(humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1)編碼的反式激活蛋白TAT中含有一段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)聯(lián)的多肽片段，稱之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain，PTD)。雖然來(lái)源于HIV-1，但它不具備任何復(fù)制性和毒性。TAT-PTD介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程不依賴于靶細(xì)胞膜上的受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也不需要能量，

5、在4℃下仍然可以進(jìn)行。目前推測(cè)這一過(guò)程和PTD中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關(guān)，這些氨基酸帶有強(qiáng)的正電荷，可能通過(guò)直接與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂類相互作用而介導(dǎo)穿膜過(guò)程。這也使得其可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞，包括破骨細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及原代細(xì)胞等常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，甚至還可以穿過(guò)血腦屏障。 本實(shí)驗(yàn)的目的是利用大腸桿菌高效表達(dá)可溶性重組TAT/CT-1蛋白，并觀察其在小鼠體內(nèi)的分布，以滿足對(duì)CT-1生物學(xué)作用進(jìn)一步研究的需要。

6、 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)是生命科學(xué)中常用的示蹤劑，具有無(wú)種屬特異性，無(wú)須抗體、輔因子或酶底物等其他介質(zhì)，即可在活細(xì)胞中及固定的組織樣品中直接進(jìn)行檢測(cè)等特點(diǎn)，故本研究擬同時(shí)構(gòu)建TAT/EGFP質(zhì)粒，為融合蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的分布觀察提供方便。 本課題的研究主要包括以下三個(gè)部分，所用到的主要方法及結(jié)果如下： 第一部分融合原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TAT/

7、CT-1，pGEX-TAT/EGFP的構(gòu)建 1.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CT-1基因，膠回收擴(kuò)增后的CT-1，后直接進(jìn)行雙酶切。雙酶切后的CT-1基因再次膠回收，純化后與經(jīng)雙酶切，膠回收純化的pGEX-4T3載體在16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌落在37℃下震搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預(yù)期地方出現(xiàn)目的條帶。命名此質(zhì)粒為pGEX-CT-1。雙酶切TAT基因，膠回收后與雙酶切，膠回收純化的載體在16℃連接過(guò)

8、夜，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌落在37℃下震搖，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預(yù)期地方出現(xiàn)目的條帶。命名此質(zhì)粒為pGEX-TAT/CT-1，測(cè)序顯示無(wú)PCR引起的突變，基因無(wú)移碼，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.采用PCR技術(shù)對(duì)EGFP基因進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收擴(kuò)增后的EGFP，純化后直接進(jìn)行雙酶切。雙酶切后的EGFP基因再次膠回收，純化后與經(jīng)雙酶切，膠回收純化的載體pGEX-TAT在16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆菌

9、落在37℃下震搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示在預(yù)期地方出現(xiàn)目的條帶，命名此質(zhì)粒為pGEX-TAT/EGFP，測(cè)序顯示無(wú)PCR引起的突變，基因無(wú)移碼，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 第二部分融合蛋白TAT/CT-1，TAT/EGFP的表達(dá)與純化 將原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TAT/CT-1，pGEX-TAT/EGFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21中后，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)，超聲裂菌，離心，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明

10、表達(dá)的TAT/CT-1，TAT/EGFP蛋白均有可溶性和包涵體兩種存在形式。雖然在37℃誘導(dǎo)時(shí)蛋白表達(dá)量最高，但包涵體含量也高；降低誘導(dǎo)溫度，在25℃時(shí)，TAT/CT-1,TAT/EGFP可溶性蛋白含量均為最高。因此本實(shí)驗(yàn)采用25℃誘導(dǎo)4小時(shí)為誘導(dǎo)條件。 重組菌經(jīng)超聲裂解后，上清經(jīng)瓊脂糖谷胱甘肽4B孵育，還原性谷胱甘肽洗脫，產(chǎn)物SDS-PAGE分析表明在相對(duì)分子量49.7×103，和55.1×103處分別由有與TAT/CT-1和

11、TAT/EGFP融合蛋白分子量相當(dāng)?shù)牡鞍讞l帶。融合蛋白純度均達(dá)90％左右，濃度均在1.2mg/ml以上， 第三部分融合蛋白TAT/CT-1，TAT/EGFP在小鼠體內(nèi)分布的初步觀察 體重28-32g的昆明小鼠經(jīng)尾靜脈分別注射約含500μgTAT/CT-1,TAT/EGFP融合蛋白的無(wú)菌溶液0.5ml。注射4小時(shí)后戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，由左心室用生理鹽水50ml沖洗，取腦，脊髓，肝，心肌等器官組織做恒冷箱切片，片厚10μ