TAT-Cytoglobin融合蛋白促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和抗肝纖維化初步研究.pdf

1、細(xì)胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)是Kawada等在大鼠肝星狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種六配位血紅素球蛋白,分子量為21.4 kDa。目前研究表明Cygb具有過(guò)氧化物酶活性和清除氧自由基的功能,并能通過(guò)調(diào)控Cygb基因的表達(dá)抑制肝纖維化。但Cygb作為一種胞漿蛋白,且在細(xì)胞表面無(wú)Cygb受體的情況下,外源Cygb無(wú)法主動(dòng)進(jìn)出細(xì)胞,發(fā)揮其抗氧化、抗炎癥及抗肝纖維化等生物學(xué)功能。本論文結(jié)合穿膜肽TAT的穿膜作用和Cygb的生物學(xué)功能,制備及

2、探討TAT-Cygb融合蛋白在促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化方面的作用。
　　首先,通過(guò)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)E. coli BL21/pET22b-TAT-Cygb中的TAT-Cygb融合蛋白,經(jīng)CM陽(yáng)離子交換層析、S-100分子篩層析、G-25分子篩脫鹽等分離純化過(guò)程,以及SDS-PAGE、LC/MS和Western blot鑒定,得到純度>95％、濃度為3.273 mg/mL、過(guò)氧化物酶比活力為(422.63±3.17)U/mg的TAT

3、-Cygb,并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定TAT-Cygb的穿膜能力;其次,利用H2O2氧化應(yīng)激損傷模型和超氧化物陰離子熒光探針證明TAT-Cygb對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用和治療氧化損傷的作用,并能降低細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子的水平,而無(wú)穿膜能力的Cygb無(wú)法緩解已氧化損傷的細(xì)胞;再次,利用二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型驗(yàn)證TAT-Cygb的抗炎作用,在大鼠全層皮膚切除的創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)中,TAT-Cygb可發(fā)揮抗炎作用促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合,并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激防

4、止成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖或遷移,從而有效減輕皮膚愈合后瘢痕修復(fù)區(qū)域的大小;最后,在抗小鼠肝纖維化實(shí)驗(yàn)中,高劑量的TAT-Cygb可逆轉(zhuǎn)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化,與模型組相比,肝臟內(nèi)膠原纖維含量明顯減少,肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,肝功能指標(biāo)和纖維化血清標(biāo)志物等含量均趨于正常。
　　本論文首次利用TAT的穿膜能力介導(dǎo)Cygb進(jìn)入胞內(nèi),并證明TAT-Cygb融合蛋白具有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化的作用,為后續(xù)開展Cygb抗炎癥、抗衰老、抗肝纖