細胞穿膜肽TaT-Hsp70融合蛋白對小鼠早期體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、細胞穿膜肽Tat是一種能攜帶生物大分子物質進入細胞的一段氨基酸序列，通過這種方式進入細胞的大分子物質會保持其原有生物學活性，這種特性為將目的蛋白轉入細胞提供了新的途徑。本試驗在表達得到具有穿膜功能的Hsp70-Tat-Hsp70的基礎上，通過將其加入胚胎培養(yǎng)液中，統(tǒng)計囊胚發(fā)育率和孵出率的方法，研究在培養(yǎng)液中添加Tat-Hsp70融合蛋白對小鼠早期胚胎發(fā)育影響。試驗方法及結果如下:
　　 1.小鼠Tat-Hsp70原核表達載體的構

2、建及表達
　　 TRIzol法提取小鼠肝臟總RNA，經反轉錄和PCR擴增，將擴增產物連接到pMD-18T載體上，并轉化入大腸桿菌DH5α中，陽性菌落經PCR鑒定后進行測序。以pMD-18T/Hsp70質粒為模板，利用PCR的方法成功將Tat基因連入，并構建成pEASY-E1/Tat-Hsp70表達載體，測序鑒定后進行蛋白表達。結果顯示該蛋白以可溶性蛋白形式存在，最佳表達條件為:溫度30℃，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導時

3、間3h，western blot檢測說明其具有生物學活性。
　　 2.含有Tat-Hsp70融合蛋白的CZB培養(yǎng)對小鼠早期胚胎發(fā)育的影響
　　 分別配制CZB及TCZB（含有Tat-Hsp70融合蛋白的CZB培養(yǎng)液），當胚胎發(fā)育到4細胞后，將胚胎隨機分組,分別換用CZB和TCZB進行培養(yǎng)，換液2h后分別進行39℃和41℃的熱應激處理2h，處理完畢恢復37℃正常溫度進行培養(yǎng)，分別統(tǒng)計囊胚發(fā)育率和孵出率，以37℃正常培養(yǎng)的胚

4、胎為對照。結果顯示39℃熱應激后，囊胚發(fā)育率和孵出率在CZB組（80.2±5.4和73.4±6.2）與TCZB組（81.3±4.5和76.5±7.6）間無顯著差異(P＞0.05)，與對照組(83.7±6.1和75.6±4.5)比亦無顯著差異(P＞0.05);而41℃熱應激后，囊胚發(fā)育率和孵出率在CZB組（80.2±5.4和73.4±6.2）、TCZB組(81.3±4.5和76.5±7.6)與對照組三組之間存在顯著差異(P＜0.05)，對