線粒體融合蛋白2對小鼠植入前早期胚胎發(fā)育的影響及機制研究.pdf

1、第一部分Mfn2基因干擾序列的篩選及最佳轉(zhuǎn)染濃度的確定
　　目的:確定小鼠線粒體融合素基因2(Mitofusin2,Mfn2)小干擾RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)轉(zhuǎn)染所需最佳濃度,篩選沉默Mfn2效率最高的siRNA序列。
　　方法:分別將20nM、30nM、50nM和100nM的Cy3標記siRNA轉(zhuǎn)染至TM4細胞,24h后觀察細胞熒光強度,篩選出Cy3-siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度;以Lipofe

2、ctamine2000為轉(zhuǎn)染介質(zhì),將預先設計的三條Mfn2-siRNA序列分別轉(zhuǎn)染TM4細胞,通過熒光定量PCR(quantityRealTime-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細胞的Mfn2mRNA的相對表達量。
　　結(jié)果:不同濃度Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中,20nM、30nM、50nM和100nM的轉(zhuǎn)染效率分別為20％、30%、70%和90%,其中50nM和100nM轉(zhuǎn)染熒光強度明顯增強,轉(zhuǎn)染效率高;在預選的3條Mfn2-siRNA序列

3、中,同control-siRNA轉(zhuǎn)染組相比,Mfn2-siRNA1、Mfn2-siRNA2和Mfn2-siRNA3組Mfn2表達量百分比分別為6.20%、3.08%和17.68%。Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組均較control-siRNA組明顯下降(P<0.05),其中Mfn2-siRNA2轉(zhuǎn)染細胞的Mfn2mRNA表達量最低。
　　結(jié)論:當Cy3-siRNA濃度為50nM時,TM4細胞轉(zhuǎn)染效率已達所需水平,故確定50nM為siRN

4、A最佳轉(zhuǎn)染濃度;在預選的3條Mfn2-siRNA序列中,Mfn2-siRNA2(5’CUGGACAGCUGGAUUGAUAdTdT3’,3’dTdTGACCUGUCGACCUAACUAU5’)轉(zhuǎn)染細胞的Mfn2表達量最低,為最佳轉(zhuǎn)染序列。
　　第二部分Mfn2基因沉默對小鼠植入前胚胎發(fā)育的影響
　　目:的觀察Mfn2-siRNA對小鼠受精卵體外分裂速度及囊胚形成率的影響。
　　方法:使用Mfn2的最佳轉(zhuǎn)染序列(Mfn2

5、-siRNA2)及對照序列(control-siRNA)合成化學修飾的siRNA,分別轉(zhuǎn)染至小鼠輸卵管分離的兩細胞受精卵中,通過熒光定量PCR檢測干擾效率并觀察兩組中受精卵的分裂速度及囊胚形成率。
　　結(jié)果:Mfn2-siRNA中Mfn2的表達量為control-siRNA轉(zhuǎn)染組受精卵的0.8%,Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于control-siRNA組(P<0.05),Mfn2-siRNA較control-siRNA轉(zhuǎn)染組受

6、精卵生長速率明顯減慢,Mfn2-siRNA和control-siRNA囊胚形成率分別為23.19%和72.95%,Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低。
　　結(jié)論Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組的受精卵與control-siRNA轉(zhuǎn)染組相比生長速率明顯下降,囊胚形成率降低,表明Mfn2可影響小鼠植入前胚胎的發(fā)育,Mfn2的正常表達對小鼠受精卵的發(fā)育具有重要作用。
　　第三部分Mfn2影響小鼠植入前胚胎發(fā)育的機制探討
　　目的觀

7、察Mfn2基因沉默對小鼠胚胎早期發(fā)育過程中線粒體功能的影響,探討Mfn2對小鼠植入前胚胎發(fā)育影響的作用機制。
　　方法分別收集Mfn2-siRNA和control-siRNA轉(zhuǎn)染組的囊胚30個,用螢火蟲熒光素酶法檢測囊胚的ATP含量,用JC-1染料測量囊胚中的線粒體膜電位。用FITC標記的重組人AnnexinⅤ熒光探針檢測小鼠早期胚胎凋亡情況。
　　結(jié)果Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組的囊胚ATP含量顯著降低(P<0.05)及細胞

8、線粒體膜電位低于control-siRNA轉(zhuǎn)染組;Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡明顯較control-siRNA轉(zhuǎn)染組多。
　　結(jié)論與control-siRNA轉(zhuǎn)染組相比,Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組小鼠囊胚ATP產(chǎn)生減少,線粒體膜電位降低,表明Mfn2表達降低抑制線粒體能量代謝;Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率增加,表明Mfn2的低表達可導致線粒體途徑誘導的細胞凋亡增加。結(jié)果提示Mfn2可能通過影響小鼠植入前胚胎中的線粒