鴉膽子苦醇對小鼠早期胚胎發(fā)育的阻滯作用及其機制探究.pdf

1、哺乳動物的早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控是生命科學(xué)研究的重要課題之一，是精細(xì)而又復(fù)雜的有序調(diào)控過程，包括受精卵的分裂、緊密態(tài)、桑葚胚和囊胚的形成。植入前胚胎的正常發(fā)育對胚胎著床及產(chǎn)生健康子代的十分重要，在此期間胚胎受到眾多蛋白因子的調(diào)控，任何基因表達異常都有可能導(dǎo)致受精卵發(fā)育障礙。雖然已有很多文獻報道哺乳動物的植入前胚胎發(fā)育的相關(guān)研究，但是對于其潛在的分子機制仍不十分清楚。因此，研究可能影響胚胎發(fā)育的因素，對于揭示哺乳動物生殖規(guī)律、改善胚胎質(zhì)量

2、以及預(yù)防出生缺陷提供新的理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。
　　Nuclear factor E2-related factor2（Nrf2），是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，眾所周知的是調(diào)節(jié)著體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)眾多抗氧化反應(yīng)，可增強細(xì)胞對氧化應(yīng)激和親電子化學(xué)物質(zhì)的抗性。生理條件下，含有Cul3泛素連接酶活性的Keap1可以降解Nrf2蛋白，Keap1-Nrf2體系使可誘導(dǎo)的抗氧化防護和細(xì)胞的生物能學(xué)協(xié)調(diào)的結(jié)合起來。中藥鴉膽子是一種常用的抗腫瘤中草

3、藥，鴉膽子苦醇(Brusatol)是來源于鴉膽子的主要成分，是一種Nrf2的天然抑制劑。本實驗選用昆明小鼠植入前胚胎為實驗材料，利用Brusatol抑制Nrf2蛋白表達，驗證Nrf2在小鼠植入前胚胎發(fā)育中的表達，探究不同濃度的Brusatol對植入前胚胎發(fā)育潛能的影響，評估Nrf2對維持胚胎質(zhì)量過程中貢獻。
　　本課題研究用不同濃度Brusatol處理小鼠植入前胚胎的合子期細(xì)胞，觀察細(xì)胞在不同濃度下的發(fā)育率并篩出最佳濃度;應(yīng)用免疫

4、熒光檢測Nrf2蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育的不同時期即2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚的表達和定位;通過實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因及其激酶在2-細(xì)胞期胚胎的mRNA水平表達的變化并通過EdU檢測細(xì)胞周期;Western blot驗證Brusatol對Nrf2蛋白表達的影響;再通過合子期添加Brusatol的同時過表達Nrf2激活質(zhì)粒證明Nrf2確實在其中發(fā)揮作用;最后通過γ-H2AX抗體染色分析細(xì)胞中DNA損傷程度。研究結(jié)

5、果表明Brusatol確實可以下調(diào)Nrf2蛋白的表達。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)從2-細(xì)胞期到囊胚期Nrf2主要定位在細(xì)胞質(zhì)并且富集在細(xì)胞核。不同濃度的Brusatol處理后細(xì)胞發(fā)育率隨濃度升高成負(fù)相關(guān)，用200nM Brusatol處理后幾乎沒有細(xì)胞發(fā)育到4細(xì)胞期，并且大部分細(xì)胞停滯在2-細(xì)胞期。我們進一步用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)和對照組相比，Brusatol抑制劑組的Cyclin B及其激酶CDK1和CyclinE及其激酶CDK2以及其下游Rb

6、的mRNA水平均降低。γ-H2AX染色后熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核并未被著色說明Brusatol處理細(xì)胞可能不是通過DNA損傷來發(fā)揮作用。顯微注射后同時添加Brusatol后觀察細(xì)胞發(fā)育的潛能與只添加Brusatol組相比顯示恢復(fù)了部分發(fā)育潛能。
　　因此我們得出結(jié)論，在小鼠早期胚胎發(fā)育中Brusatol確實可以抑制Nrf2蛋白表達，并且結(jié)果表明抑制Nrf2表達可影響有絲分裂細(xì)胞周期，這可能是體外胚胎發(fā)育障礙的主要原因之一。Brus