截斷型人轉(zhuǎn)化生長因子受體Ⅱ真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf

1、肝纖維化在慢性肝病的病理生理過程中占重要地位，阻斷其向肝硬化發(fā)展，促使其逆轉(zhuǎn)具有重要意義，而轉(zhuǎn)化生長因子β在該過程中起重要作用，本課題旨在利用現(xiàn)代分子生物學和基因工程技術(shù)構(gòu)建一個沒有胞內(nèi)段的不能轉(zhuǎn)導胞外信號的截斷型人轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體的表達載體，為進一步研究其生物學效應(yīng)及在肝硬化中的作用奠定基礎(chǔ)。 目的：構(gòu)建無細胞內(nèi)段基因的人轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(△TβRⅡ)的真核表達載體pEGFP/△TβRⅡ，轉(zhuǎn)染人胚肝細胞L02以表達

2、融合蛋白EGFP/△TβRⅡ，并檢測其胞外段的生物學活性。 方法：以質(zhì)粒H2-3FF為模板，用PCR方法擴增得到人轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(TβRⅡ)胞外段和跨膜段的cDNA，并在兩端分別引入EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶位點，將該cDNA經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切、純化回收后克隆到真核表達載體pEGFP-N2上，構(gòu)建成pEGFP/△TβRⅡ重組質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和核酸測序鑒定，將該重組質(zhì)粒由脂質(zhì)體Lipofectamin20

3、00介導轉(zhuǎn)染人胚肝細胞L02，用倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白EGFP的表達，加入G418篩選得到陽性克隆，并用四唑鹽(MTT)比色法和流式細胞術(shù)(FCM)檢測其生物學活性。 結(jié)果：①重組質(zhì)粒pEGFP/△TβRⅡ經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，得到兩個陽性片斷，其中小片段帶與PCR產(chǎn)物條帶在相同位置，大小分別約為619bp；大片段條帶與空載體pEGFP-N2骨架在同一位置，大小約為4.7kb，符合預(yù)期結(jié)果，并經(jīng)核酸測序鑒定序列正確

4、，表明△TβRⅡ已經(jīng)克隆至pEGFP-N2載體中；②重組質(zhì)粒pEGFP/△TβRⅡ轉(zhuǎn)染L02人胚肝細胞24h后在熒光顯微鏡下觀察到融合蛋白EGFP的表達，并用G418篩選得到穩(wěn)定表達的陽性克?。?③MTT比色結(jié)果：轉(zhuǎn)染重組子的實驗組OD值顯著高于轉(zhuǎn)染pEGFP-N2的對照組OD值(0.780±0.012vs0.335±0.018，p＜0.05)；FCM結(jié)果顯示前者的G1％(63.58)明顯低于后者的G1％(73.03)，而增殖指