以β-淀粉樣蛋白為靶的單價(jià)及二價(jià)真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、該室構(gòu)建了pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>真核表達(dá)質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究Aβ<,42>主動(dòng)免疫清除老年斑的作用機(jī)理和DNA疫苗的研制奠定基礎(chǔ).一、Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA的提取和目的基因擴(kuò)增.飽和酚/氯仿法鼠尾提取Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA,根據(jù)其基因序列,設(shè)計(jì)出擴(kuò)增編碼Aβ基因的引物,以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-

2、2>.二、真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>的構(gòu)建及鑒定.將目的基因片段Aβ<,1-42>純化后與質(zhì)粒pcDNA3.1分別用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ酶切、純化后用T<,4>DNA連接酶將目的基因片段定向克隆至質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)間,得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-A β<,1-42>,將目的基因片段Aβ<,42-1>純化后與質(zhì)粒pcDNA3.1分別用兩種限制性內(nèi)切酶

3、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ酶切、純化后用T<,4>DNA連接酶將目的基因片段Aβ<,42-1>定向克隆至質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)間.三、peDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>的真核表達(dá).無菌提取質(zhì)粒pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>,用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,對(duì)其表達(dá)的蛋白進(jìn)行Western Blotting鑒定,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)

4、行免疫組化染色,證實(shí)其能在真核細(xì)胞中表達(dá)出目的蛋白.綜上所述,該研究成功地?cái)U(kuò)增了目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-2>,并將Aβ<,1-42>、Aβ<,42×2>基因分別克隆到真核表達(dá)載體上,成功地構(gòu)建單價(jià)及二價(jià)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>.將構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,證實(shí)了其可在真核細(xì)胞中表達(dá),為我們下一步將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因鼠奠定了基礎(chǔ)