pIRES2-AcGFP1-CD真核表達載體的構建及其在MSCs中的表達.pdf

1、大連理工大學碩士學位論文pIRES2-AcGFP1-CD真核表達載體的構建及其在MSCs中的表達姓名：陳一曲申請學位級別：碩士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：馬學虎;崔占峰20070620p l R E S 2 - A c G F P l - C D 真核表達載體的構建及其在M S C s 中的表達C o n s t r u c t i o no f p l R E S 2 ·- A c G F P 1 ·- C De

2、u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d a n di t se x p r e s s i o n i nb o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e m c e l l s ( M S C s )A b s t r a c tC y t o s i n ed e a m i n a s e ( C D ) i s a l le n

3、 z y m e f o u n d i na v a r i e t yo f b a c t e r i a a n d f u n g i w h e r e i sc a p a b l eo f d e a m i n a t i n gc y t o s i n et ou r a c i l ．n l ee x i s t e n c eo f C D i na p r o k a r y o f i cc e l lr

4、e n d e r st h ec e l ls e l e c t i v e l ys e n s i t i v e t o5 一F C ．S e l e c t i v ee x p r e s s i o n o f C D w i t h i n n e o p l a s t i cc e l l sw h e nc o m b i n e dw i t hs y s t e m i c 5 ．．F Ca d m i n

5、i s t r a t i o nm a y r e s u l ti nl o c a l l y h i g h c o n c e n t r a t i o no f 5 ．．F Uw h i l e m i n i r n i 2 f i n gt h es y s t e m i c 5 ．F Ut o x i c i t y ．C u r r e n t l y ．m e s e n c h y m a ls t e mc

6、 e i l s ( M S C s ) i s a h o t i n t [ e r e s ti n t h e s t e m c e l l ’sa r e a ．M S C sC a n t r a n s d i f f e r e n t i a t ei n t om u l t i p l ec e l l l i n e a g e s ．1 1 璩c h a r a c t e ro fM S C s ．f o

7、r e x a m p l et h em u l t i p o t e n t i o n , e a s yi s o l a t i o n , c u l t i v a t i o na n dp r o l i f e r a t i o n ，l o wi m m u n o g e n i c i t y ，e a s yb et r a n s f e c t e da n d e x p r e s s i o n

8、 e x o t i cg e n ea n ds oo n , m a k e s t h e m i d e a le n g i n e e r i n gc e l l si ne e l la n d g e n e t h e r a p i e s ．I n t h i ss t u d y ．M S C s o f r a b b i ti su s e d a se n g i n e e r i n g c e l

9、l st oe x p r e s s t h eC D ．C D g e n ei sc o n s t r u c t e dw i t l l f l u o r e s c e n tr e c o m b i n a t a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s m i d ．a n d t h e n t h ep l a s m i di st r a n

10、s f e c t e di n t o M S C s f o r g e n e t h e r a p y o f c e n t r a l n e I ' V O U Ss y s t e m d i s e a s e s ．A c c o r d i n gt o t h e o p e nr e a d i n gf r a m eo ft h ec y t o s i n e d e a m i n a s e

11、g e n e ，t h e s p e c i f i co i l g o n u c l e o t i d ep r i m e r sa r ed e s i g n e d ．R e s t r i c t i o ne n z y m e Ⅺ1 0 Ia n dB a m H I a l ed e s i g n e da tt h e5 ’e n da n d t h e3 ’e n d ．r e s p e c t i

12、 v e l y ．1 1 1 ec y t o s i n ed e a m i n a s e g e n ei s o b t a i n e df r o mE ．c o l iJ M l 0 9 g e n o m e D N A b y P o l y m e r a s eC h a i n R e a c t i o n ( P C R ) ．A f t e r h a r v e s t e da n d p u r

13、i f i e d ．t h ef r a g m e n t i Sc l o n e di n t op M D l 9 一T v e c t o r ．a n dt h e n t h e s ea r e t r a n s f e r r e di n t oD H 5 a c o m p e t e n tc e l l s ．P o s i t i v ec l o n e sa r e s e l e c t e db

14、yL B p l a t e sw i 也A m p i c i l l i n a n d p r o l i f e r a t e d ．B y d i g e s t i o nw i t h r e s t r i c t i o ne n z y m e B a m l - I I ／X h o la n d D N A s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tC D

15、 g e n eW a si d e n t i c a lw i t ht h ep u b l i s h e ds e q u e n c e ．n ep l R E S 2 一A e G F P l - C D p l a s m i di Sc o n s t r u c t e da n dt h e n i d e n t i f i e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e B

16、a m H I ／X h o I d i g e s t i o n a n a l y s i s ．T h r o u g hl i p o s o m e - m e d i a t e dm e t h o dt h ep l a s m i d i S t r a n s f e c t e d i n t ot h em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ．T h

17、e t r a n s f e c t e dm a r r o wm e s e n c h y m a ls t e m c e l l s d i s p l a yg r e e nf l u o r e s c e n c eu n d e rf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ．T o t r a n s f e c t i o n M S C s u s i n g p

18、l R E S 2 - A c G F P l - C D p l a s m i d sc o n d u c t e db y l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 l i p o s o m e s i s as i m p l e ，e f f i c i e n t ，e a s y a n ds u c c e s s f u lt r a n s f e c t i o nm e t h o

19、d ．I t i s a f a i r l y i d e a lg e n em e t h o d , a n dv e r y l i k e l y t h a t b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e m c e l l s t ob e c o m e t h ei d e a l v e c t o ri ng e n e t h r a p y ．K e y w o