抗人CD33單鏈抗體及其與CD80胞外區(qū)融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及功能檢測.pdf

1、目的：構(gòu)建及表達(dá)抗人CD33單鏈抗體(CD33scFv)基因，并檢測其生物活性；擴增CD80胞外區(qū)，構(gòu)建ExCD80-CD33scFv融合基因，并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，進(jìn)一步檢測融合蛋白的生物活性。 方法：HIM3—4是血研所研制的分泌鼠源性抗人CD33單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并已獲得國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會議正式命名。我們利用RT-PCR技術(shù)分別克隆了抗人CD33單克隆抗體HIM3—4的輕、重鏈可變區(qū)基因，并利用短肽

2、(Gly4Ser)。作為linker，通過overlap PCR方法組裝成抗人CD33scFv。將獲得的抗體基因克隆到具有強啟動子的PET28a(+)載體上，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)證明具有與靶抗原人類CD33特異結(jié)合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠贈，我們通過另行設(shè)計帶所需酶切位點的引物來擴增CD80胞外區(qū)，在此基礎(chǔ)上，利用人血清白蛋白(HAS)第三結(jié)構(gòu)域親水性的403—427位氨基酸作為鏈間連接肽將抗人CD33

3、單鏈抗體及人類細(xì)胞表面抗原CD80胞外區(qū)基因分別經(jīng)酶切、純化后克隆至原核表達(dá)載體PET22b(+)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌內(nèi)獲得了融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白的成功構(gòu)建與表達(dá)，為下一步探討血液腫瘤的免疫治療機制奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)果：⑴通過RT-PCR方法，利用通用引物從HIM3—4雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，分別為321bp和366bp，我們利用(GGGS)。為連接肽構(gòu)建了抗人CD33基因工程單鏈抗體，并在PET2

4、8a(+)中得到表達(dá)，蛋白大小約為31KD，經(jīng)復(fù)性后具有與人CD33結(jié)合活性。⑵克隆出CD80胞外區(qū)序列，大小為633bp。3利用大小為25Aa的鏈間鏈接肽，將CD80胞外區(qū)與CD33ScFv連為融合表達(dá)基因，并在PET22b(+)中得到表達(dá)，蛋白大小約為55KD，經(jīng)復(fù)性后具有與人CD33抗原結(jié)合活性。 結(jié)論：①從HIM3—4雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)測序為功能性重排的抗體可變區(qū)基因。②用(Gly4Ser)。連