蜜蜂毒肽能成分的提純及其生物學(xué)功能的鑒定.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)中使用凝膠層析(gelchromatography，GC)和反相高壓液相色譜法(reverse-phasehighpressureliquidchromatography,RP-HPLC)來(lái)分離純化蜜蜂粗毒中的肽能成分，通過質(zhì)譜法和N-末端氨基酸序列分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，大鼠足底皮下注射每種肽能成分通過行為學(xué)方法來(lái)觀察它們的生物學(xué)活性。主要研究工作如下： 1.蜜蜂粗毒中肽能成分的分離、純化和鑒定。 BV溶液經(jīng)過葡聚

2、糖凝膠G-10層析柱濾過后被分成四個(gè)成分(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4)，用分子量小于3000Da的醋酸纖維素膜超濾后，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)檢測(cè)每個(gè)成分的分子量。MALDI-TOFMS檢測(cè)分子量為1-40kDa的蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，誤差范圍一般為蛋白質(zhì)或多肽分

3、子量的±0.1％。本實(shí)驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)技巧、儀器設(shè)備和同位素的存在，所測(cè)多肽分子量的誤差一般在±10。F1的分子量為2847.30Da，與蜜蜂毒肽(2848Da)的分子量相近。F2(2027.29Da)，F(xiàn)3(2027.29Da)和F4(2027.23Da)的分子量與蜂毒明肽(2027Da)的分子量相近。 為了進(jìn)一步明確GC主要峰F1中所含有的肽能成分，運(yùn)用反相高壓液相色譜法，至少獲得13個(gè)亞峰。前6個(gè)亞峰為鹽峰，被剔除掉。2個(gè)亞

4、峰(F107和F111)由于純度太低不適于進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，因此MALDI-TOFMS和N-末端氨基酸序列分析對(duì)另外5個(gè)亞峰所含肽能成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。分析結(jié)果顯示：F108是蜂毒明肽，F(xiàn)109和F110都是MCDP，F(xiàn)113是蜜蜂毒肽。F112N-末端的8個(gè)氨基酸序列與PLA2具有100％同源性，因此我們將其命名為PLA2相關(guān)肽(PLA2-relatedpeptide)。 2.蜜蜂毒肽能成分對(duì)大鼠痛相關(guān)行為和炎癥的影響。

5、 2.1局部炎癥反應(yīng)。 大鼠足底皮下分別注射高劑量(100μg/50μl)5個(gè)亞峰(F108，F(xiàn)109，F(xiàn)110，F(xiàn)112和F113)，都能引起明顯的紅腫反應(yīng)，呈放射狀擴(kuò)散，逐漸覆蓋注射足的整個(gè)足底表面。紅腫持續(xù)8-24h，足體積增長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)[(處理后-基線)/基線×100％]進(jìn)行比較，相對(duì)腫脹強(qiáng)度的順序?yàn)椋篎110(74％)≈F109(61％)≈F113(53％)≈F112(51％)＞F108(28％)，表明MCDP、蜜蜂毒肽

6、和PLA2相關(guān)肽是蜜蜂粗毒中最重要的致炎成分，而蜂毒明肽的作用相對(duì)較弱。 2.2自發(fā)性傷害性反應(yīng)。 為了觀察蜜蜂毒的5個(gè)亞峰是否能引起自發(fā)性傷害性反應(yīng)，我們將每個(gè)亞峰100μg溶于50μl生理鹽水，然后注射于大鼠一側(cè)足底皮下。5個(gè)亞峰中只有4個(gè)(F109，F(xiàn)110，F(xiàn)112和F113)能產(chǎn)生明顯的自發(fā)性傷害性反應(yīng)，其中蜜蜂毒肽產(chǎn)生自發(fā)性傷害性反應(yīng)的時(shí)程最長(zhǎng)，傷害性反應(yīng)的強(qiáng)度最強(qiáng)。 2.3熱和機(jī)械痛敏。

7、 大鼠足底皮下注射劑量為100μg/50μl的蜜蜂毒肽能成分，在2h，4h，8h，24h和48h觀察注射部位對(duì)熱或機(jī)械刺激反應(yīng)的敏感性。皮下注射F113和F108后的2h和4h熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(pawwithdrawalthermallatency,PWTL)明顯縮短，而注射F109，F(xiàn)110和F112沒有引起PWTL的改變，表明除了蜜蜂毒肽，蜂毒明肽也能引起注射部位的熱痛敏。 在5個(gè)亞峰肽能成分中，皮下注射F108(

8、蜂毒明肽)和F113(蜜蜂毒肽)2h后，機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(pawwithdrawalmechanicalthreshold，PWMT)明顯降低。而且皮下注射蜜蜂毒肽后2-48h注射部位對(duì)機(jī)械刺激的敏感性顯著增加。F109，F(xiàn)110和F112卻不能改變PWMT的基線值。 2.4外周使用capsazepine(CPZ)對(duì)蜜蜂毒肽誘導(dǎo)的自發(fā)性傷害性反應(yīng)和痛覺敏感性的影響。 為了進(jìn)一步揭露蜜蜂毒肽誘導(dǎo)的自發(fā)性傷害性反應(yīng)和

9、痛覺敏感性的作用機(jī)制，大鼠足底皮下注射蜜蜂毒肽前或后，同一部位也接受單劑量熱傷害性感受器(transientreceptorpotentialvanilloidreceptor1，TRPV1)拮抗劑CPZ(0.3μg/50μl)，與生理鹽水組比較，CPZ置前或置后處理，1h內(nèi)觀察到的蜜蜂毒肽誘導(dǎo)的自發(fā)性縮足反應(yīng)的次數(shù)明顯減少。生理鹽水對(duì)照組皮下注射蜜蜂毒肽2h測(cè)得注射部位的PWTL降低了55-70％，然而，相同劑量的CPZ置前給藥56％

10、阻斷原發(fā)性熱痛敏的發(fā)展，置后給藥58％的逆轉(zhuǎn)原發(fā)性熱痛敏的維持，CPZ置前或置后給藥都不能阻斷或逆轉(zhuǎn)蜜蜂毒肽誘導(dǎo)的原發(fā)性機(jī)械痛敏。蜜蜂毒肽注射足接受CPZ處理后不能改變對(duì)側(cè)后足的PWTL和PWMT，進(jìn)而排除了CPZ的系統(tǒng)作用。 研究結(jié)論： 1.通過GC和RP-HPLC分離純化以及MALDI-TOFMS和N-未端氨基酸序列分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，我們得到5個(gè)肽能峰：F108為蜂毒明肽，F(xiàn)109為MCDP，F(xiàn)110為MCDP，