基于抗原組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護(hù)性抗原.pdf

1、蛇類在地球上有著廣泛的分布,目前已被發(fā)現(xiàn)的蛇類多達(dá)3000多種,其中只有15％的蛇類是具有毒性的,對(duì)人類健康造成威脅。毒蛇咬傷主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶農(nóng)村地區(qū),特別是低收入國家農(nóng)村地區(qū),因此許多毒蛇咬傷病例未予報(bào)告,造成流行病學(xué)資料缺失,蛇傷的具體發(fā)病情況難以得到正確統(tǒng)計(jì)。據(jù)報(bào)道,全球每年大約有2500000蛇咬傷病例發(fā)生,大約有125000人因毒蛇咬傷死亡。在2009年,世界衛(wèi)生組織(WHO)首次承認(rèn),蛇咬傷是一個(gè)被長期忽視的公眾健康問

2、題。
　　尖吻蝮蛇是我國特有的蛇種,主要分布在中國南方地區(qū),其分泌的毒液中含有多種毒素成分,目前研究較多的毒素成分是金屬蛋白酶(Metalloproteinase)、磷酯酶A2(Phospholipase A2)、絲氨酸蛋白酶(Serine proteases)、C型凝集素(C-type lectin-like protein)。尖吻蝮蛇蛇毒具有很強(qiáng)的血液毒性,中毒后常造成全身系統(tǒng)性的出血,局部組織壞死,給臨床治療帶來困難。

3、>　　噬菌體展示肽庫技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的,用于模擬抗原研究的新技術(shù),這一技術(shù)現(xiàn)已成功的運(yùn)用于模擬抗原篩選,并能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答,其基本原理是:在噬菌體表面插入各種組合的氨基酸短肽,通過抗原抗體識(shí)別反應(yīng),使含有特定蛋白的噬菌體,從肽庫中篩選出來,通過測(cè)序獲得特定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息?，F(xiàn)這一技術(shù)在確定抗原表位、篩選小分子模擬肽、疫苗開發(fā)、分子診斷等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
　　研究目的:
　　利用尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔,通

4、過實(shí)驗(yàn)純化制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體的生物活性;在純化尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體的基礎(chǔ)上,利用噬菌體展示肽庫技術(shù),篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護(hù)性抗原,并采用基因工程技術(shù),合成、表達(dá)重組抗原肽,對(duì)重組抗原肽免疫保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,從而為新型抗蛇毒血清的研究奠定基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　第一部分:
　　以尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔,并利用Econo-Pac Protein A kit及CN

5、Br activated sepharose4B凝膠對(duì)兔源性抗蛇毒抗體進(jìn)行純化,制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,用Western blot和ELISA對(duì)抗體進(jìn)行評(píng)價(jià),通過出血抑制實(shí)驗(yàn)及致死性保護(hù)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗體的生物活性。
　　第二部分:
　　以抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體為靶蛋白,對(duì)噬菌體隨機(jī)肽庫進(jìn)行三輪生物淘選,獲得與抗體特異性結(jié)合噬菌體陽性克隆,通過ELISA法和Western blot測(cè)定噬菌體單克隆與抗體的結(jié)合力,進(jìn)一步

6、篩選陽性克隆,對(duì)候選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,得到插入短肽氨基酸序列,利用基因工程技術(shù),對(duì)篩選獲得的抗原片斷進(jìn)行串聯(lián)重組表達(dá),獲得重組抗原肽,將重組抗原肽免疫BALB/C小鼠,并通過出血抑制實(shí)驗(yàn),評(píng)估重組抗原肽的免疫保護(hù)效果。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1)成功地制備了抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,通過ELISA法檢測(cè),抗蛇毒抗體滴度>1:3200;Western blot分析示:多克隆抗體與蛇毒中大多數(shù)毒素蛋白結(jié)合;體外出血抑制試驗(yàn)顯示

7、該抗體能有效地抑制尖吻蝮蛇蛇毒所導(dǎo)致的皮內(nèi)出血;在致死性保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,多克隆抗體對(duì)2LD50和4LD50蛇毒分別起到100%和54%的保護(hù)作用。
　　2)在本研究中,利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選出5個(gè)抗原表位,將該部分抗原進(jìn)行串聯(lián)重組表達(dá),獲得重組抗原肽,通過 ELISA實(shí)驗(yàn)證明,重組抗原肽能有效的刺激小鼠產(chǎn)生抗體,該抗體能與重組抗原肽結(jié)合,也能被蛇毒抗原識(shí)別,與重組抗原肽識(shí)別滴度達(dá)到1:64000,與蛇毒識(shí)別滴度達(dá)到1:8000。在