布魯氏菌疫苗株104M的蛋白質(zhì)組學(xué)研究與保護(hù)性抗原篩選.pdf

1、布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，具有多個(gè)種型，它所引起的布魯氏病是一種人畜共患的國家乙類傳染病。近年來，我國的布魯氏病疫情非常嚴(yán)峻，感染人數(shù)迅速攀升，帶來較大危害。此外，布魯氏菌具有在環(huán)境中存活能力強(qiáng)、易被氣溶膠化等特點(diǎn)，可能被用作生物恐怖劑。布魯氏菌對(duì)我國的人民健康和生物安全帶來嚴(yán)重威脅，對(duì)其進(jìn)行深入研究具有重要意義。疫苗是防控布魯氏病的有效手段。目前，獸用布魯氏菌疫苗已獲得廣泛使用，在控制布魯氏病疫情方面起到重要作用，而人

2、用布魯氏菌疫苗研制較為困難，國外尚未有疫苗上市，我國唯一批準(zhǔn)人用的布魯氏菌疫苗為減毒活疫苗104M株。人用布魯氏菌疫苗研制困難的主要原因，可能在于布魯氏菌存在多個(gè)種型，且保護(hù)性抗原譜復(fù)雜，單一抗原很難起到完全保護(hù)作用。隨著組學(xué)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，反向疫苗學(xué)逐漸成為研制新型疫苗的重要方法。反向疫苗學(xué)以組學(xué)和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行抗原預(yù)測，并隨后對(duì)預(yù)測的候選抗原進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)，進(jìn)而獲得有效的保護(hù)性抗原用于新型疫苗研制。國內(nèi)外利用反向疫苗學(xué)篩選

3、布魯氏菌抗原已有一些研究，但相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)還不完善。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，獲得高覆蓋率的蛋白質(zhì)組并采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)反向注釋基因組成為可能，即蛋白質(zhì)基因組學(xué)。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)方法也是研究布魯氏菌本身生理代謝與致病機(jī)制的重要工具。
　　本研究首先通過蛋白質(zhì)基因組學(xué)方法來完善布魯氏菌104M株的組學(xué)數(shù)據(jù)。隨后通過定量蛋白質(zhì)組技術(shù)研究布魯氏菌在模擬胞內(nèi)應(yīng)激條件下的差異蛋白質(zhì)組，進(jìn)而為了解布魯氏菌的胞內(nèi)寄生機(jī)制提供線索。在此基礎(chǔ)上，建

4、立綜合組學(xué)與生物信息學(xué)的保護(hù)性抗原篩選新策略，對(duì)布魯氏菌保護(hù)性抗原進(jìn)行預(yù)測，篩選并驗(yàn)證疫苗候選抗原，為新型人用布魯氏菌疫苗設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
　　在蛋白質(zhì)基因組學(xué)方面，本研究建立了多策略蛋白質(zhì)組質(zhì)譜鑒定方法，分別采用SDS-PAGE和液相色譜預(yù)分離方法，對(duì)104M全蛋白質(zhì)組與膜蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面的質(zhì)譜鑒定，并對(duì)104M基因組進(jìn)行反向重注釋，獲得了較高覆蓋率的104M株蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。共鑒定到蛋白1729個(gè)（總注釋蛋白3072個(gè)），覆蓋率

5、達(dá)56.3％。鑒定蛋白在等電點(diǎn)、分子量、疏水性、跨膜區(qū)等方面分布情況與104M注釋基因相符。鑒定蛋白覆蓋了幾乎全部 COG功能分類（20/22），體現(xiàn)出功能分布的全面性。本研究還鑒定到17個(gè)重要已知保護(hù)性抗原和14個(gè)關(guān)鍵毒力基因在104M中大量表達(dá)，為了解104M免疫保護(hù)性與殘余毒性提供了依據(jù)。同時(shí)，驗(yàn)證了218個(gè)假想蛋白的存在，并對(duì)假想蛋白的功能進(jìn)行了分析預(yù)測，其中26個(gè)為膜或分泌蛋白，57個(gè)為潛在保護(hù)性抗原或毒力基因。對(duì)104M基因

6、組重注釋，發(fā)現(xiàn)了6處新基因并糾正了3處基因注釋錯(cuò)誤，并利用RT-PCR方法對(duì)這些基因進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，在蛋白質(zhì)組水平發(fā)現(xiàn)了104M大小染色體在蛋白豐度上的差異，提示大染色體上蛋白表達(dá)量可能高于小染色體，并初步探討了導(dǎo)致差異的機(jī)理。
　　在定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面，本研究采用Label-free定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，通過設(shè)置多組應(yīng)激條件模擬胞內(nèi)生存環(huán)境，探究多應(yīng)激綜合作用下布魯氏菌生理與代謝的改變機(jī)制。共設(shè)置1個(gè)正常體外培養(yǎng)條件對(duì)照組（

7、TSB），7個(gè)單一應(yīng)激條件組：血清、營養(yǎng)限制、理化應(yīng)激、氧化/氮化應(yīng)激、缺氧、鐵缺乏、抗菌肽，以及1個(gè)綜合應(yīng)激組來模擬胞內(nèi)生存環(huán)境。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)條件相比，104M在不同應(yīng)激條件下生存率不同（3.2%-73.2%），營養(yǎng)限制、氮化/氧化應(yīng)激以及缺氧環(huán)境對(duì)104M的生存具有較大影響。對(duì)各應(yīng)激條件下生長的104M菌株蛋白進(jìn)行Label-free定量質(zhì)譜鑒定，共鑒定到定量蛋白2272個(gè)，其中1221個(gè)蛋白在應(yīng)激條件下表達(dá)與對(duì)照組相比具有

8、顯著差異。這些差異表達(dá)蛋白主要富集在氧化磷酸化、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分系統(tǒng)、次生代謝物的生物合成、卟啉和葉綠素代謝、甘油磷脂代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、硫胺代謝、氮代謝、碳代謝等與布魯氏菌胞內(nèi)生存和環(huán)境壓力適應(yīng)密切相關(guān)的代謝通路上，為深入了解布魯氏菌的胞內(nèi)生存機(jī)制提供了線索。
　　在保護(hù)性抗原篩選方面，本研究總結(jié)了與保護(hù)性抗原預(yù)測相關(guān)的多種因素，最終選定了6個(gè)關(guān)鍵因素，包括蛋白亞細(xì)胞定位、保護(hù)組相似性、抗原性、表位、毒力基因、

9、粘附素，進(jìn)行預(yù)測打分，將打分?jǐn)?shù)據(jù)綜合后排序，建立了“多因素保護(hù)性抗原預(yù)測法”（Multi-factor Prediction of Protective Antigens，MPPA）。通過已知的保護(hù)性抗原數(shù)據(jù)庫與非保護(hù)性抗原數(shù)據(jù)庫對(duì) MPPA進(jìn)行方法驗(yàn)證，證明其可以有效區(qū)分保護(hù)性抗原與非保護(hù)性抗原，預(yù)測效果良好（靈敏性0.783、特異性0.940），優(yōu)于國外報(bào)道的預(yù)測篩選方法。應(yīng)用MPPA篩選布魯氏菌104M株保護(hù)性抗原，共獲得高概率保

10、護(hù)性抗原26個(gè)，其中包含9個(gè)已知布魯氏菌保護(hù)性抗原，如Omp19、Omp25、Omp31、SodC和Invasion protein B等，進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選方法的可行性。同時(shí)還篩選到多個(gè)潛在的新保護(hù)性抗原，包括外膜脂蛋白LipA、Ⅰ型分泌系統(tǒng)蛋白HlyD、Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白VirB8、外膜外排蛋白TolC和受體蛋白TonB等，為新型人用布魯氏菌疫苗的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　在候選抗原保護(hù)性驗(yàn)證方面，本研究選擇了4個(gè)代表性保護(hù)性抗原

11、Omp19、VirB8、HlyD和LipA進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)。分別通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)和純化獲得了Omp19、VirB8、HlyD和LipA重組蛋白抗原，在小鼠模型上進(jìn)行免疫原性和保護(hù)效力評(píng)價(jià)。血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，Omp19、VirB8和HlyD免疫后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，總抗體IgG滴度分別為8.2×105，3.0×105與3.3×106。Omp19與VirB8抗體亞類以IgG1為主，為Th2偏向；HlyD抗體亞類以

12、IgG2a為主，為 Th1偏向。通過分離各組免疫后小鼠脾細(xì)胞，在體外用對(duì)應(yīng)抗原刺激培養(yǎng)，檢測細(xì)胞因子TNF-a、IFN-γ、IL-6和IL-10的分泌水平，結(jié)果顯示Omp19、VirB8和HlyD能夠較好的刺激機(jī)體產(chǎn)生以TNF-α、IFN-γ為特征的Th1型免疫反應(yīng)，和以IL-6、IL-10為特征的Th2型免疫反應(yīng)。布魯氏菌A19攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Omp19、VirB8和HlyD免疫小鼠后，可以顯著降低脾臟與肝臟中細(xì)菌定值數(shù)，具有較好的

13、保護(hù)效果。
　　綜上所述，本研究通過串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)布魯氏菌疫苗株104M進(jìn)行了蛋白質(zhì)基因組學(xué)研究，獲得了迄今為止最高覆蓋率的布魯氏菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，并完善了基因組注釋；通過Label-free定量蛋白質(zhì)組方法研究了布魯氏菌在模擬胞內(nèi)應(yīng)激條件下的差異蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了涉及布魯氏菌胞內(nèi)生存和環(huán)境壓力適應(yīng)的多個(gè)重要通路，為深入了解布魯氏菌的胞內(nèi)生存機(jī)制提供了重要線索；在組學(xué)研究基礎(chǔ)上，建立了“多因素保護(hù)性抗原預(yù)測法”（MPPA），對(duì)104