壞死梭桿菌保護(hù)性抗原確定與基因篩選研究.pdf

1、本項(xiàng)研究建立了壞死梭桿菌FN(A)P2001小鼠感染模型，對(duì)壞死梭桿菌免疫原及保護(hù)性抗原進(jìn)行了篩選研究，通過對(duì)保護(hù)性抗原的氨基酸序列測(cè)定和基因篩選研究，結(jié)合保護(hù)性抗原的生物學(xué)試驗(yàn)，確定溶血素是壞死梭桿菌的保護(hù)性抗原，是致病的主要物質(zhì)。該項(xiàng)研究為壞死梭桿菌疫苗研制及免疫機(jī)理研究打下了基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下： 實(shí)驗(yàn)將鹿源壞死梭桿菌FN(A)p2001分離株以不同菌量，不同途徑接種于小鼠，逐日觀察小鼠感染情況，死亡小鼠進(jìn)行病理學(xué)檢查和細(xì)菌

2、分離鑒定。結(jié)果表明，壞死梭桿菌FN(A)P2001分離株具有很強(qiáng)的感染毒力，對(duì)小鼠的最小致死量為106個(gè)/只菌量，腹腔接種是適宜的感染途徑，從而建立了壞死梭桿菌分離株小鼠感染模型。 將壞死桿菌菌體裂解，分別將上清和沉淀制成抗原，免疫家兔制備抗血清，利用抗血清通過SDS-PAGE電泳及Western-blot技術(shù)對(duì)免疫組分進(jìn)行篩選研究。回收雜交陽(yáng)性的蛋白條帶，分別免疫小鼠，利用對(duì)流免疫電泳檢測(cè)血清抗體。結(jié)果，F(xiàn)N(A)型菌株的3條

3、蛋白帶和FN(AB)型菌株的1條蛋白帶有免疫原性。 分別切取FN(A)型菌株和FN(AB)型菌株有免疫原性的蛋白帶，免疫小鼠。用對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)檢測(cè)免疫效果。免疫4周后進(jìn)行攻毒(107個(gè)菌/只)。結(jié)果FN(A)型菌的55KD抗原有免疫保護(hù)性。用55KD抗原免疫血清，分別與各菌株裂解抗原進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果，F(xiàn)N(AB)型菌裂解抗原與免疫血清間無沉淀線，F(xiàn)N(A)型菌的5株菌與免疫血清間有沉淀線，且沉淀線末端完全融合。證明FN(

4、A)型菌的5個(gè)菌株的抗原可產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，并具有相同的抗原決定簇。 將壞死梭桿菌FN(A)型菌的2菌株培養(yǎng)后離心，沉淀用滅菌去離子水稀釋，加胰酶裂解菌體。菌體上清液用60％飽和度的硫酸銨鹽析，沉淀經(jīng)懸浮式透析裝置透析，收集樣品。將透析后的粗分離保護(hù)性抗原樣品用凝膠層析柱分離純化，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳及Western-blot選出目的蛋白帶，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行蛋白質(zhì)N末端序列測(cè)定。結(jié)果2株FN(A)型壞死梭桿菌提取

5、的保護(hù)性抗原，N端氨基酸序列基本相同(各測(cè)10個(gè)氨基酸，只有第一位不同)。經(jīng)GenBank檢索，在已報(bào)道的壞死梭桿菌蛋白質(zhì)氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)與測(cè)序結(jié)果相同的序列。 依據(jù)測(cè)出的氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物及反向PCR引物。以簡(jiǎn)并性引物與隨機(jī)引物篩選、反向PCR篩選法、以及目的基因富集篩選方法對(duì)抗原基因進(jìn)行篩選。對(duì)篩選出的序列利用NCBI和EBI中的BLAST和Clustal進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析、序列比對(duì)及核苷酸序列拼接。通過對(duì)