TGEV纖突糖蛋白保護(hù)性抗原基因克隆、測序及表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。不同年齡和不同品種的豬對(duì)本病都易感，2周齡以內(nèi)的仔豬具有高度感染性，以仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為主要臨床特征，致死率可達(dá)100％。本病常常由于混合感染和細(xì)菌繼發(fā)感染，難以確診，缺乏有效疫苗，給各國養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害。 對(duì)TGEV的研究表明，S基因編碼的S蛋

2、白，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供黏膜免疫保護(hù)作用主要的結(jié)構(gòu)蛋白。其上的重要保護(hù)性抗原位點(diǎn)A、D，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體中起關(guān)鍵作用。A位點(diǎn)缺失可導(dǎo)致S蛋白不能產(chǎn)生中和抗體，喪失黏膜免疫保護(hù)功能。D位點(diǎn)在中和抗體產(chǎn)生中也起著重要的作用。由此可見，對(duì)于S基因重要保護(hù)性抗原位點(diǎn)A、D基因的克隆及表達(dá)的研究就顯得尤為重要。 本研究根據(jù)Genbank上發(fā)表的TGEV-TH-98株S基因cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)擴(kuò)增A、D位點(diǎn)的引物P1

3、，P2。將自行分離的TGEV-JL 毒株接種于單層PK-15細(xì)胞增殖病毒。提取TGEV-JL 株基因組RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增出含A、D兩抗原位點(diǎn)的目的片段S<,1>基因，片段大小為 1 218bp。將S<,1>基因克隆到pMD18-T 克隆載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMD18-S<,1>。對(duì)pMD18-S<,1>進(jìn)行鑒定后，再將S<,1>基因亞克隆到pET-32a原核表達(dá)載體的EcoRI和SalI之間的多克隆位點(diǎn)上，進(jìn)而構(gòu)建了重組原核表

4、達(dá)質(zhì)粒pET-S<,1>。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-S<,1>轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21中，用終濃度為1mmol/L的IPTG對(duì)宿主表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明：S<,1>基因在原核表達(dá)系統(tǒng) pET-32a 中獲得表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白大小約為 44KD。Western-blot檢測表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被 TGEV 陽性血清所識(shí)別。由此說明，表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 上述結(jié)果提示，克隆的S<,1