白眉蝮蛇去整合素Adinbitor對腫瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、去整合素(disintegrins)是從蛇毒中提取的一類同源性很高的多肽，含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列或Lys-Gly-Asp(KGD)序列，半胱氨酸含量豐富，分子量為5～9kD[1]。因為大部分細(xì)胞整合素(integrins)都能識別RGD序列，而大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白成分都含有RGD序列，故去整合素可憑借其RGD識別序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競爭性拮抗

2、劑，從而抑制整合素參與的多種生理活動。 去整合素Adinbitor是由來自于中國旅順的白眉蝮蛇又名短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)，學(xué)名為Agkistrodonhalysbrevicaudusstejneger的蛇毒中克隆得到的。Adinbitor由73個氨基酸殘基組成，含有12個半胱氨酸殘基和1個去整合素特征性RGD三肽識別序列，相對分子量為9kD，為去整合素家族的新成員，故可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑

3、，具有抑制腫瘤的作用。 腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段的長期復(fù)雜的過程，其細(xì)胞信號傳遞系統(tǒng)出現(xiàn)了明顯的缺陷，整合素作為信號傳導(dǎo)者發(fā)揮著重要作用。研究證明不同的整合素成員在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平有差異，在腫瘤發(fā)生的不同階段表現(xiàn)為截然不同的作用，表明整合素可通過傳遞特定的信號或誘導(dǎo)基因表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移、凋亡以及腫瘤血管的生成等事件。而所有的去整合素都具有其生物學(xué)活性所必需的RGD特異性識別序列，憑借此序列去整

4、合素可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑，抑制整合素在腫瘤發(fā)生過程中的各種作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)去整合素能夠抑制腫瘤細(xì)胞對纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白和膠原的粘附，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，同時去整合素還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的特異作用。 鑒于此，本論文將凍存的新鮮陽性表達(dá)菌E.coliBL21，即其已完成帶有組氨酸標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET23b-adinbitor的轉(zhuǎn)化和鑒定，進(jìn)行復(fù)蘇和IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，得到重組蛋白Adi

5、nbitor的可溶性高效表達(dá)，經(jīng)組氨酸親和層析柱純化，獲得了分子量為9kD的去整合素Adinbitor，從而在去整合素Adinbitor對人胃癌細(xì)胞MGC803的增殖、凋亡、粘附、浸潤和轉(zhuǎn)移方面進(jìn)行研究。 去整合素Adinbitor對人胃癌細(xì)胞MGC803增殖影響的實(shí)驗采用MTT比色法，結(jié)果表明，Adinbitor可呈劑量依賴性方式抑制MGC803細(xì)胞的增殖，其抑制MGC803細(xì)胞增殖的ID50為3.52μmol/L。在其誘導(dǎo)M

6、GC803細(xì)胞凋亡實(shí)驗中，采用相差顯微鏡直接觀察和蘇木精-伊紅(HE)染色進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示出細(xì)胞凋亡的典型的形態(tài)學(xué)特征如胞間連絲消失，細(xì)胞皺縮成團(tuán)，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象，而且隨Adinbitor濃度的增加而越發(fā)明顯。進(jìn)一步采用Hoechst染色也可檢測到Adinbitor具有誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞發(fā)生凋亡的功能，在熒光顯微鏡下經(jīng)紫外光激發(fā)，凋亡的細(xì)胞核發(fā)出耀眼的藍(lán)光，細(xì)胞明顯皺縮成團(tuán)，并且隨Adinbitor濃度的增加，凋亡越發(fā)明顯；而未

7、經(jīng)Adinbitor處理的細(xì)胞染色淡且均勻，呈均勻分布。接下來的Adinbitor對MGC803細(xì)胞的粘附抑制實(shí)驗，結(jié)果為Adinbitor對MGC803細(xì)胞粘附于纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)具有明顯的抑制作用，3.5μmol/L濃度的Adinbitor對MGC803細(xì)胞粘附于FN(2h)的抑制率約為44﹪；對粘附于人工基底膜基質(zhì)Matrigel也同樣具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。其后的轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗中，結(jié)果呈現(xiàn)出對經(jīng)A

8、dinbitor處理的MGC803細(xì)胞從Transwell上室向下室遷移的抑制作用，并且隨著Adinbitor濃度的增加抑制作用越發(fā)增強(qiáng)。在采用人工基底膜基質(zhì)Matrigel及Transwell模擬體內(nèi)環(huán)境的浸潤抑制實(shí)驗中，也顯示出同樣具有抑制浸潤作用的結(jié)果，且也隨著Adinbitor濃度的增加抑制作用越發(fā)明顯。 總之，本論文通過誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得了重組蛋白即去整合素Adinbitor，在體外研究其對人胃癌細(xì)胞MGC803作用。