逼尿肌細(xì)胞、ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景及目的： 本研究擬以細(xì)胞鈣瞬變?yōu)橛^察指標(biāo)，比較分析ICCs細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的特征及發(fā)生機(jī)制；并以反映平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的STOCs和鈣火花(Ca2+ spark)為觀察指標(biāo)，通過(guò)利用FKBP12.6基因敲除小鼠，對(duì)cADPR調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣釋放的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究將有助于我們深入對(duì)平滑肌細(xì)胞和ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變特征、發(fā)生和調(diào)控的認(rèn)識(shí)，并為闡明膀胱ICCs細(xì)胞的功能提供初步的研究證據(jù)。本研究擬從以下

2、四個(gè)方面展開： 第一：利用免疫熒光單染及雙染的方法，觀察ICCs細(xì)胞在逼尿肌組織中的分布及與平滑肌細(xì)胞的關(guān)系，為后續(xù)平滑肌細(xì)胞和ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的檢測(cè)提供參考； 第二：對(duì)膀胱逼尿肌組織鋪片中的平滑肌細(xì)胞和相鄰ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變進(jìn)行檢測(cè)，比較分析兩種細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的頻率和幅度，初步探討平滑肌相鄰ICCs細(xì)胞可能的功能； 第三：檢測(cè)細(xì)胞外鈣內(nèi)流及細(xì)胞鈣庫(kù)中鈣釋放干預(yù)因素對(duì)細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的影響，探討細(xì)

3、胞外鈣內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣釋放入胞漿在兩種細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生的作用； 第四：對(duì)比野生型和FKBP12.6基因敲除小鼠中cADPR對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞STOCs、鈣火花及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)總鈣含量的影響，探討cADPR調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣釋放這-cADPR調(diào)控細(xì)胞鈣瞬變發(fā)生關(guān)鍵環(huán)節(jié)的機(jī)制，為深入了解cADPR調(diào)控平滑肌細(xì)胞鈣瞬變的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本研究采用2-3月齡SD大鼠為研究對(duì)象。首先利用免疫熒光方法檢測(cè)逼尿肌組織

4、中ICCs細(xì)胞的分布及其與平滑肌細(xì)胞的關(guān)系。隨后參照Hashitani等[18]的方法制作膀胱組織鋪片，于記錄Chamber底部Physiological saline生理液灌流保持肌條鋪片活性。待肌條自發(fā)性收縮活動(dòng)出現(xiàn)后，F(xiàn)luo-4 AM負(fù)載肌條鋪片，激光共聚焦顯微鏡觀察鋪片中平滑肌細(xì)胞和ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變，隨后分別觀察L型、T型鈣離子通道阻斷劑Nimodipine、Nicl2，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體拮抗劑2-aminoethoxy

5、 diphenylborate(2-APB)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ayR受體拮抗劑Ryanodine，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR受體激動(dòng)劑Caffeine，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑Thapsigargin及無(wú)鈣、高鈣生理液對(duì)平滑肌細(xì)胞和ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的影響，探討平滑肌細(xì)胞和ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變產(chǎn)生、調(diào)控的機(jī)制。 最后利用FKBP12.6基因敲除小鼠探討cADPR調(diào)節(jié)膀胱平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣釋放的機(jī)制。通過(guò)PCR方法對(duì)敲除小鼠的基因表型進(jìn)行鑒定。通過(guò)膜

6、片鉗記錄cADPR對(duì)平滑肌細(xì)胞自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(spontaneous transient out currents，STOCs)的影響，使用膜片鉗和激光共聚焦顯微鏡共記錄的方法，同步觀察cADPR對(duì)平滑肌細(xì)胞STOCs和鈣火花(Ca2+ spark)的影響。利用激光共聚焦顯微鏡觀察cADPR對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞鈣火花特征的影響，并通過(guò)Thapsigargin預(yù)處理了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵是否參與cADPR調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞中鈣釋放作用。利用Wes

7、tern blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)cADPR作用后，F(xiàn)KBP12.6從RyR2上釋放入胞漿的情況。利用雙Puff系統(tǒng)，通過(guò)瞬時(shí)使用10mM Caffeine，探討cADPR對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中總鈣含量的影響。 結(jié)果： 1.SD大鼠膀胱逼尿肌組織中存在ICCs細(xì)胞，ICCs細(xì)胞在逼尿肌肌束旁、肌束間和肌束內(nèi)均有分布；ICCs細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)末梢在空間結(jié)構(gòu)上緊密相鄰：肌束旁和肌束間的ICCs細(xì)胞有時(shí)可連成一片，有可能成為相鄰

8、肌束之間聯(lián)系的“橋梁”； 2.逼尿肌組織鋪片中平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的特征如下： (1)逼尿肌組織鋪片F(xiàn)luo-4剛負(fù)載完成時(shí)，平滑肌束中平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變多不同步；熱的生理液灌流20-30min后，平滑肌束中平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變趨于同步； (2)平滑肌細(xì)胞鈣瞬變多起源于肌束邊緣，而后傳遞到肌束的另一側(cè)；部分鈣瞬變可起源于肌束中部，而后向肌束兩側(cè)傳遞； (3)平滑肌細(xì)胞鈣瞬變?cè)诩∈鴥?nèi)縱向傳遞幾乎無(wú)時(shí)

9、間延遲，但其在肌束內(nèi)橫向傳遞有一定的時(shí)間延遲； (4)觀察到相鄰的肌束間可通過(guò)肌束間細(xì)胞進(jìn)行鈣瞬變的傳遞。 3.成功同時(shí)記錄到膀胱逼尿肌組織鋪片中平滑肌細(xì)胞和肌束旁ICCs細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變，平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變頻率相對(duì)較快，而肌束旁ICCs細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變頻率相對(duì)較慢； 4.膀胱逼尿肌組織鋪片中的藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)： (1)L型鈣離子通道阻斷劑Nimodipine能完全抑制平滑肌細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變，但

10、對(duì)ICCs細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變無(wú)顯著影響；T型鈣離子通道阻斷劑Nicl2可明顯降低平滑肌細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變的頻率，對(duì)平滑肌細(xì)胞鈣瞬變的幅度及ICCs細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變無(wú)明顯影響； (2)Ryanodine，Caffeine，2-APB，和Thapsigargin均可對(duì)平滑肌細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變產(chǎn)生顯著的抑制作用，但不能完全消除平滑肌細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生； (3)Ryanodine，Caffeine，2-APB，和Thap

11、sigargin及無(wú)鈣生理液均可完全抑制ICCs細(xì)胞的自發(fā)性鈣瞬變，高鈣生理液可顯著增加ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的頻率而降低其頻率。 5.成功對(duì)FKBP12.6基因敲除小鼠進(jìn)行了基因表型鑒定。經(jīng)鑒定，基因敲除小鼠繁殖后，表現(xiàn)為三種基因表型：純合子(FKBP12.6-/-)、雜合子(FKBP12.6+/-)和野生型(FKBP12.6+/+)； 6.cADPR可顯著增大野生型小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞的STOCs，對(duì)FKBP12.6

12、基因敲除小鼠(純和子)平滑肌細(xì)胞STOCs卻無(wú)明顯影響； 7.膜片鉗和激光共聚焦顯微鏡共記錄的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cADPR可顯著增強(qiáng)野生型小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞的STOCs及鈣火花，但對(duì)FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌細(xì)胞STOCs及鈣火花卻無(wú)明顯影響； 8.cADPR對(duì)野生型小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞鈣火花有顯著影響，而對(duì)FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌細(xì)胞鈣火花卻無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。具體表現(xiàn)為：cADPR可顯著提高野生型小鼠膀胱平滑

13、肌細(xì)胞鈣火花的頻率、幅度及FWHM距離，明顯延長(zhǎng)其上升時(shí)間和半數(shù)衰減時(shí)間：而cADPR對(duì)FKBP12.6基因敲除小鼠細(xì)胞鈣火花的上述特征性指標(biāo)無(wú)明顯影響； 9.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑Thapsigargin對(duì)cADPR調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放的作用無(wú)明顯影響； 10.Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，cADPR可使FKBP12.6從RyR2上脫落下來(lái)，釋放入胞漿中； 11.cADPR可顯著降低野生型小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞

14、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的總鈣含量，而對(duì)FKBP12.6基因敲除小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的總鈣含量卻無(wú)明顯影響。 結(jié)論： 1.膀胱平滑肌自發(fā)性鈣瞬變?cè)诩∈锌v向傳遞和橫向傳遞的延遲不同可能來(lái)自傳遞機(jī)制的不同，而肌束間鈣瞬變的傳遞增強(qiáng)可能參與DI的發(fā)生； 2.熱生理液灌流使肌束中平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變趨于同步及鈣瞬變多起源于肌束邊緣提示：膀胱逼尿肌組織中存在起搏細(xì)胞的可能性很大，可能是膀胱起搏細(xì)胞的是：①肌束一側(cè)的平滑肌細(xì)胞和②肌束旁或肌束內(nèi)

15、ICCs細(xì)胞；鈣瞬變也可起源于肌束中部，提示不同部位的膀胱平滑肌組織起搏細(xì)胞的分布可能存在差異； 3.膀胱組織鋪片中平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變頻率明顯快于肌束旁ICCs細(xì)胞，提示平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變起源于肌束旁ICCs細(xì)胞的可能性不大；考慮到目前肌束內(nèi)ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變尚不能進(jìn)行檢測(cè)，及目前技術(shù)手段對(duì)ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變觀察的限制，不排除肌束內(nèi)和具有不同功能的肌束旁ICCs細(xì)胞是膀胱起搏細(xì)胞的可能性； 4.細(xì)胞外

16、鈣通過(guò)L型鈣離子通道入胞在平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生中起主要作用，而細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中的鈣釋放入胞漿可能起輔助作用；Ca2+通過(guò)T型鈣離子通道入胞則可影響細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生頻率； 5.細(xì)胞外鈣通過(guò)非L型鈣離子通道入胞及胞內(nèi)鈣庫(kù)中的鈣釋放均參與ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生；參與ICCs細(xì)胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生的細(xì)胞膜上的非L型鈣離子通道可能是①鈉鈣交換體NCX、②T型鈣離子通道和③TRP(瞬時(shí)受體勢(shì))離子通道中的多個(gè)通道： 6