Junctophilin2對小鼠心肌細胞鈣瞬變的影響.pdf

1、背景介紹：
　　膜耦聯(lián)復合物（junctional membrane complexes，JMCs）是與心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)相關的耦聯(lián)細胞表面膜與肌質(zhì)網(wǎng)膜的細胞結構物質(zhì)。在心肌細胞中， JMCs是由心肌細胞肌漿膜向內(nèi)凹陷形成T管，以及肌質(zhì)網(wǎng)膜形成的“二聯(lián)體”結構。功能上，JMCs是細胞膜表面膜與細胞肌漿網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum/endo reticulum，SR/ER）離子通道之間實現(xiàn)有效交通的結構基礎。J

2、unctophilin（JP， JPH）是參與形成JMCs的蛋白分子，在哺乳類動物的可興奮細胞，JPH的基因JPH1、JPH2、JPH3和JPH4分別編碼其4個蛋白亞型: JPH1～JPH4[1]。由JPH2基因編碼的蛋白亞型Junctophilin2可促進心肌“二聯(lián)體”的形成和穩(wěn)定，也是心肌細胞Ca2+信號系統(tǒng)穩(wěn)定傳導的關鍵分子[2]。RyR2（ryanodine receptor type2）是心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)膜上ryanodine受

3、體（ryanodine receptors，RyRs）的通道亞型。心肌肌質(zhì)網(wǎng)因為含有大量Ca2+，有心肌細胞內(nèi)“鈣庫”之稱。RyR2作為心肌肌質(zhì)網(wǎng)主要的Ca2+釋放通道存在[3]。胞漿中Ca2+的產(chǎn)生途徑主要是細胞膜上的電壓門控Ca2+通道（voltage-gated Ca2+channels,VGCC）介導的細胞外Ca2+內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng) RyRs介導的肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi) Ca2+的釋放[4]。心肌細胞產(chǎn)生動作電位（ action potentia

4、l，AP）使VGCC開放，引起細胞外少量Ca2+內(nèi)流。內(nèi)流的Ca2+作為細胞內(nèi)的信號激活肌質(zhì)網(wǎng)RyR2通道，從而導致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+大量釋放進入胞漿，此過程成為鈣離子誘導的鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)。
　　Ca2+是維持和調(diào)節(jié)心臟生理功能以及體內(nèi)多種生理過程的重要信號分子。
　　JPH2的敲減引起鈣相關的興奮收縮耦聯(lián)的破壞，從而導致心肌病，例如心力衰竭。JPH2對細胞內(nèi)鈣離子

5、調(diào)控系統(tǒng)起核心作用。
　　目的：
　　本研究采用 IonOptix光譜檢測系統(tǒng)記錄培養(yǎng)的單個新生小鼠心肌細胞的鈣瞬變；采用siRNA技術構建針對JPH2基因的重組腺病毒載體，研究重組腺病毒介導的JPH2-siRNA對心肌細胞鈣瞬變的影響，以此探討JPH2在心肌細胞Ca2+調(diào)控中的作用。
　　方法：
　　1.實驗所用動物為新生1~3d的 C57BL/6小鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2012-0001，雌雄不限，

6、均購自于北京維通利華公司。
　　2.實驗所用帶有EGFP標記的重組腺病毒顆粒Ad-JPH2-siRNA及Ad-NC-siRNA（siRNA無關對照腺病毒顆粒）由上海吉凱基因公司包裝完成,并放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗分為以?組：（1）正常對照組(Ctrl-NC)，即培養(yǎng)的細胞不加任何處理；（2）無關序列對照組(Ad-NC-siRNA)；（3）重組腺病毒組(Ad-JPH2-siRNA)。
　　3.新生1~3d的C57BL

7、/6小鼠心肌細胞常規(guī)分離培養(yǎng)。培養(yǎng)的新生小鼠心肌細胞分別感染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒。熒光倒置顯微鏡觀察感染36-48h后的感染結果；
　　4.采用IonOptix光譜檢測系統(tǒng)分別對感染腺病毒36h的培養(yǎng)的心肌細胞進行鈣瞬變的檢測：心肌細胞加入終濃度為2μM的Fura-2/AM，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，有鈣臺氏液清洗，局部電場刺激（電壓8V,1.0Hz,脈寬4ms）誘發(fā)鈣瞬變。Io

8、nOptix光譜檢測系統(tǒng)所用激發(fā)波長340/380 nm。
　　5.采用IonWizard6.6(美國IonOptix公司)軟件分析鈣瞬變的以下指標：BL:Baseline(RU); Peak h:Peak height(RU); Peak t:Time to peak(s);Dep V:Departure velocity(RU/s);Ret V:Returnvelocity(RU/s);TP90％:Time to90% pea

9、k(s);TB90%:Time to90% baseline(s)
　　6．鈣瞬變數(shù)據(jù)的分析采用IonWizard6.6(美國IonOptix公司)。SPSS21.0軟件對相關實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，以均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示，同一指標三組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較用雙側t檢驗，以p<0.05為有顯著性差異。
　　結果：
　　1.培養(yǎng)的新生小鼠心肌細胞在48-72

10、h間長成單層并且形成細胞簇，倒置顯微鏡下觀察到心肌細胞出現(xiàn)自發(fā)的強有力的搏動，證明培養(yǎng)的心肌細胞生長狀態(tài)良好；
　　2.心肌細胞轉(zhuǎn)染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒36h后，熒光顯微鏡下可觀察到心肌細胞大部分均有EGFP表達；
　　3.IonOptix光譜檢測系統(tǒng)對培養(yǎng)的單個心肌細胞（EGFP表達陽性）分別進行鈣瞬變的測定，Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒組與正常對照組(Ctrl-NC)細胞及