Junctophilin2對(duì)小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變的影響.pdf

1、背景介紹：
　　膜耦聯(lián)復(fù)合物（junctional membrane complexes，JMCs）是與心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)相關(guān)的耦聯(lián)細(xì)胞表面膜與肌質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在心肌細(xì)胞中， JMCs是由心肌細(xì)胞肌漿膜向內(nèi)凹陷形成T管，以及肌質(zhì)網(wǎng)膜形成的“二聯(lián)體”結(jié)構(gòu)。功能上，JMCs是細(xì)胞膜表面膜與細(xì)胞肌漿網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum/endo reticulum，SR/ER）離子通道之間實(shí)現(xiàn)有效交通的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。J

2、unctophilin（JP， JPH）是參與形成JMCs的蛋白分子，在哺乳類動(dòng)物的可興奮細(xì)胞，JPH的基因JPH1、JPH2、JPH3和JPH4分別編碼其4個(gè)蛋白亞型: JPH1～JPH4[1]。由JPH2基因編碼的蛋白亞型Junctophilin2可促進(jìn)心肌“二聯(lián)體”的形成和穩(wěn)定，也是心肌細(xì)胞Ca2+信號(hào)系統(tǒng)穩(wěn)定傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子[2]。RyR2（ryanodine receptor type2）是心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)膜上ryanodine受

3、體（ryanodine receptors，RyRs）的通道亞型。心肌肌質(zhì)網(wǎng)因?yàn)楹写罅緾a2+，有心肌細(xì)胞內(nèi)“鈣庫(kù)”之稱。RyR2作為心肌肌質(zhì)網(wǎng)主要的Ca2+釋放通道存在[3]。胞漿中Ca2+的產(chǎn)生途徑主要是細(xì)胞膜上的電壓門控Ca2+通道（voltage-gated Ca2+channels,VGCC）介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng) RyRs介導(dǎo)的肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi) Ca2+的釋放[4]。心肌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位（ action potentia

4、l，AP）使VGCC開放，引起細(xì)胞外少量Ca2+內(nèi)流。內(nèi)流的Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)激活肌質(zhì)網(wǎng)RyR2通道，從而導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+大量釋放進(jìn)入胞漿，此過程成為鈣離子誘導(dǎo)的鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)。
　　Ca2+是維持和調(diào)節(jié)心臟生理功能以及體內(nèi)多種生理過程的重要信號(hào)分子。
　　JPH2的敲減引起鈣相關(guān)的興奮收縮耦聯(lián)的破壞，從而導(dǎo)致心肌病，例如心力衰竭。JPH2對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子

5、調(diào)控系統(tǒng)起核心作用。
　　目的：
　　本研究采用 IonOptix光譜檢測(cè)系統(tǒng)記錄培養(yǎng)的單個(gè)新生小鼠心肌細(xì)胞的鈣瞬變；采用siRNA技術(shù)構(gòu)建針對(duì)JPH2基因的重組腺病毒載體，研究重組腺病毒介導(dǎo)的JPH2-siRNA對(duì)心肌細(xì)胞鈣瞬變的影響，以此探討JPH2在心肌細(xì)胞Ca2+調(diào)控中的作用。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為新生1~3d的 C57BL/6小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001，雌雄不限，

6、均購(gòu)自于北京維通利華公司。
　　2.實(shí)驗(yàn)所用帶有EGFP標(biāo)記的重組腺病毒顆粒Ad-JPH2-siRNA及Ad-NC-siRNA（siRNA無關(guān)對(duì)照腺病毒顆粒）由上海吉?jiǎng)P基因公司包裝完成,并放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)分為以下3組：（1）正常對(duì)照組(Ctrl-NC)，即培養(yǎng)的細(xì)胞不加任何處理；（2）無關(guān)序列對(duì)照組(Ad-NC-siRNA)；（3）重組腺病毒組(Ad-JPH2-siRNA)。
　　3.新生1~3d的C57BL

7、/6小鼠心肌細(xì)胞常規(guī)分離培養(yǎng)。培養(yǎng)的新生小鼠心肌細(xì)胞分別感染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒。熒光倒置顯微鏡觀察感染36-48h后的感染結(jié)果；
　　4.采用IonOptix光譜檢測(cè)系統(tǒng)分別對(duì)感染腺病毒36h的培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行鈣瞬變的檢測(cè)：心肌細(xì)胞加入終濃度為2μM的Fura-2/AM，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，有鈣臺(tái)氏液清洗，局部電場(chǎng)刺激（電壓8V,1.0Hz,脈寬4ms）誘發(fā)鈣瞬變。Io

8、nOptix光譜檢測(cè)系統(tǒng)所用激發(fā)波長(zhǎng)340/380 nm。
　　5.采用IonWizard6.6(美國(guó)IonOptix公司)軟件分析鈣瞬變的以下指標(biāo)：BL:Baseline(RU); Peak h:Peak height(RU); Peak t:Time to peak(s);Dep V:Departure velocity(RU/s);Ret V:Returnvelocity(RU/s);TP90％:Time to90% pea

9、k(s);TB90%:Time to90% baseline(s)
　　6．鈣瞬變數(shù)據(jù)的分析采用IonWizard6.6(美國(guó)IonOptix公司)。SPSS21.0軟件對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，同一指標(biāo)三組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以p<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的新生小鼠心肌細(xì)胞在48-72

10、h間長(zhǎng)成單層并且形成細(xì)胞簇，倒置顯微鏡下觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)的強(qiáng)有力的搏動(dòng)，證明培養(yǎng)的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；
　　2.心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒36h后，熒光顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞大部分均有EGFP表達(dá)；
　　3.IonOptix光譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)的單個(gè)心肌細(xì)胞（EGFP表達(dá)陽(yáng)性）分別進(jìn)行鈣瞬變的測(cè)定，Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒組與正常對(duì)照組(Ctrl-NC)細(xì)胞及