Junctophilin2對(duì)SK2通道表面膜表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　小電導(dǎo)Ca2+激活K+通道（Small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel）是通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道，表達(dá)在幾乎所有可興奮細(xì)胞。SK2通道是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種非電壓依賴性鉀通道，對(duì)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的改變具有很強(qiáng)的親合性，當(dāng)胞漿中的Ca2+濃度升高時(shí)，通過 Ca2+與鈣調(diào)蛋白連接誘導(dǎo)構(gòu)象改變，S K通道激活，K+外流

2、，參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化過程，尤其發(fā)生于動(dòng)作電位復(fù)極晚期，此期相當(dāng)于心肌細(xì)胞興奮性的相對(duì)不應(yīng)期和超常期，而臨床發(fā)生的心律失常多見于這一時(shí)期。因此 SK2通道對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程和構(gòu)成起關(guān)鍵作用。SK2通道表達(dá)異?？梢鹦募」δ艿淖兓赡苁菍?dǎo)致或者誘發(fā)房顫、心房撲動(dòng)等心律失常的機(jī)制之一，因此研究 SK2通道分子調(diào)控具有十分重要的意義。
　　耦聯(lián)膜復(fù)合體（junctional membrane complexs,JMCs）位于細(xì)胞膜（

3、PM）表面與內(nèi)（?。┵|(zhì)網(wǎng)（SR/ER）之間，是實(shí)現(xiàn)可興奮細(xì)胞有效功能交通的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Junctophilins（JPs，JPHs）是近年來發(fā)現(xiàn)的參與形成耦聯(lián)膜復(fù)合體重要蛋白分子，其包含有JMC特性，通過使細(xì)胞膜與內(nèi)（?。┵|(zhì)網(wǎng)膜之間保持較固定的距離而使JMC穩(wěn)定。Junctophilin2位于心肌細(xì)胞偶聯(lián)膜復(fù)合體中，是一種膜結(jié)合蛋白，它同時(shí)作用于細(xì)胞膜和內(nèi)（?。┵|(zhì)網(wǎng)膜，使兩者達(dá)到相當(dāng)近距離，可維持 Ca2+穩(wěn)態(tài)，實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞鈣誘導(dǎo)鈣釋放過

4、程（calcium-induced calcium release,CICR），在心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)正常運(yùn)轉(zhuǎn)過程中起到至關(guān)重要的作用。在肥厚性心肌病和心力衰竭等心臟疾病中顯示有JPH2蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，可引起心肌細(xì)胞鈣致鈣釋放過程減弱，興奮-收縮失耦聯(lián)。已有研究闡明Junctophilin與膜表面離子通道耦聯(lián)具有重要意義，其表達(dá)異常成為相關(guān)疾病發(fā)生的病理機(jī)制之一。
　　本實(shí)驗(yàn)室之前的研究證實(shí)通過腺病毒介導(dǎo)的靶向小鼠JPH2基

5、因的siRNA，可沉默小鼠心肌細(xì)胞JPH2蛋白的表達(dá)，有意義的是也可抑制細(xì)胞膜SK2通道的表達(dá)。為進(jìn)一步研究JPH2蛋白與SK2通道的相互作用，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，建立HEK293細(xì)胞SK2通道表達(dá)細(xì)胞株、SK2通道和JPH2蛋白共表達(dá)細(xì)胞株及SK2通道和JPH2突變蛋白共表達(dá)細(xì)胞株，采用細(xì)胞直接裂解法和細(xì)胞表面生物素標(biāo)記法，通過Western blot和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測JPH2蛋白對(duì)SK2通道表達(dá)的影響，為探討SK2通道與JP

6、H2蛋白相互作用的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　材料方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)中分別構(gòu)建pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變的重組質(zhì)粒。
　　2.培養(yǎng)HEK293細(xì)胞并傳代，參照脂質(zhì)體Lip2000操作步驟，分別將構(gòu)建的pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+

7、141突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，約48h后用熒光顯微鏡觀察各質(zhì)粒中綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)。
　　3.采用細(xì)胞直接裂解法和細(xì)胞表面生物素標(biāo)記方法分別提取轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒48h后HEK293細(xì)胞的總蛋白和膜蛋白,通過Western blot檢測SK2通道的表達(dá)水平；Western blot結(jié)果用Imag

8、eJ軟件做灰度分析后，數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用GraphPad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析學(xué)處理，不同組間SK2通道總蛋白和膜蛋白表達(dá)差異比較均采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。
　　4.通過細(xì)胞免疫化學(xué)和熒光顯微鏡觀察分別轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒48h后SK2通道在HEK293細(xì)胞上的定位與亞細(xì)胞分

9、布。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶切和測序鑒定pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，采用細(xì)胞直接裂解法提取HEK293細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞表面生物素標(biāo)記方法提取 HEK293細(xì)胞膜蛋白。轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-

10、EGFP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞相比，SK2通道總蛋白與膜蛋白表達(dá)量均有顯著增加；而轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞相比，SK2通道的總蛋白與膜蛋白表達(dá)量均顯著減少。
　　3.細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，其SK2通道主要分布于胞膜及胞質(zhì)中；轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+