版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道(small-conductance Ca2+-activated K+channels,SK,KCa2)幾乎存在于所有可興奮細(xì)胞的胞漿膜上,依賴于細(xì)胞內(nèi)的Ca2+進(jìn)行激活。SK通道家族由SK1、SK2、SK3以及一個(gè)在結(jié)構(gòu)和功能上與SK通道相似的中電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IK或稱SK4)組成。SK1
2、、SK2和SK3三個(gè)亞型在人類、小鼠和大鼠心肌細(xì)胞中均有表達(dá),參與心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化的構(gòu)成。研究顯示SK1和SK2主要表達(dá)在心房,而敲除SK2通道的動物出現(xiàn)心房細(xì)胞復(fù)極化延長,增加房顫和房撲等快速性心律失常的易感性。因此,SK2通道可能與室上性快速性心律失常有關(guān),可作為室上性快速性心律失常的治療靶點(diǎn),但它的調(diào)控機(jī)制目前還不明確。
引起SK2通道開放的細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號來源有兩條途徑:位于細(xì)胞膜上的電壓-門控Ca2+通道(v
3、oltage-gated Ca2+channels,VGCCs)及內(nèi)/肌質(zhì)網(wǎng)(endo/sarcoplasmic reticulum,ER/SR)膜上RyRs(ryanodine receptors)敏感的Ca2+釋放通道。已有研究報(bào)道指出心肌細(xì)胞膜的Cav1.3L型Ca2+通道通過α-actinin與SK2通道進(jìn)行耦聯(lián),實(shí)現(xiàn)對SK2通道的調(diào)控,這提示SK2通道可能不是直接和調(diào)控性的Ca2+通道有生理性相互作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)已
4、顯示心肌細(xì)胞膜表面的SK2通道與SR RyR2受體通道有功能性耦聯(lián),但它們二者之間耦聯(lián)的中間分子并不清楚。
本研究通過質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)的方法篩選心肌組織中與JP2相互作用的蛋白質(zhì),采用心肌組織和轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀和GST pull-down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證JP2與SK2通道、JP2與RyR2之間的相互作用,進(jìn)一步制備不同片段GST-JP2原核表達(dá)質(zhì)粒來驗(yàn)證JP2與SK2通道和RyR2發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域,并通過功
5、能性實(shí)驗(yàn)檢測JP2敲減后對鈣瞬變(calcium transients)的影響,以及JP2敲減后心肌鈣相關(guān)蛋白的表達(dá)。
研究方法:
1.采用健康成年C57BL/6小鼠,體重20-25g,雌雄不拘。
2.心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白的分離和檢測:用差速離心的方法提取成年C57BL/6小鼠心臟肌質(zhì)網(wǎng)小泡的膜蛋白。并用Western blot方法檢測膜蛋白中SK2、JP2和RyR2的蛋白,用心肌組織蛋白做陽性對照。
6、> 3.質(zhì)譜分析:心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白裂解液中加入JP2抗體或鼠源無關(guān)的抗-IgG抗體,再用proteinG-Sepharose捕獲制備免疫共沉淀復(fù)合物,進(jìn)行電泳后,考馬斯亮藍(lán)染色,選擇有差異的目標(biāo)蛋白條帶作為質(zhì)譜分析樣品,送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部進(jìn)行質(zhì)譜分析。
4.生物信息學(xué):根據(jù)文獻(xiàn)將蛋白質(zhì)篩選,用geneontology網(wǎng)站進(jìn)行分類,并在String網(wǎng)站上查出它們之間的相互作用。
5.Western blot鑒定:將
7、制備的免疫共沉淀復(fù)合物進(jìn)一步用特異性SK2和RyR2抗體進(jìn)行檢測。
6.構(gòu)建原核表達(dá)載體:使用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,將JP2全長、氨基端片段JP2-N1(1-253)和JP2-N2(216-350)、羧基端片段JP2-C(340-696)插入,構(gòu)建融合基因pGEX-4T-1-GST-JP2、pGEX-4T-1-GST-JP2-N1(aa1-253)、pGEX-4T-1-GST-JP2-N2(
8、aa216-350)和pGEX-4T-1-GST-JP2-C(aa340-696)。并用雙酶切和測序方法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
7.GST融合蛋白的原核表達(dá)和純化:將已鑒定的GST、GST-JP2以及GST-JP2不同片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化宿主菌E.Coli BL21,用IPTG26℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白,并用GST.BindTM樹脂層析柱純化融合蛋白。
8.構(gòu)建pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP
9、質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞:以pCMV6-entry-SK2和pCDNA3.1-JP2為模板,制備pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP質(zhì)粒,用雙酶切和測序方法鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒。按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。
9.GST pull-down分析:將結(jié)合了GST融合蛋白的層析柱中加入心臟裂解液或HEK293細(xì)胞裂解液,過夜孵育后用谷胱甘肽elution buffer洗脫,并用SK
10、2或RyR2抗體進(jìn)行檢測。
10.Co-IP法檢測體外JP2和SK2相互作用:將共轉(zhuǎn)染SK2和JP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞裂解液與抗體過夜孵育,再用proteinG-Sepharose制備免疫共沉淀復(fù)合物;再分別用抗SK2和抗JP2抗體進(jìn)行檢測。
11.尾靜脈注射腺病毒:給健康成年C57BL/6小鼠尾靜脈注射總量為1×109PFU的攜帶陰性對照siRNA(Ad-NC)或JP2-siRNA(Ad-siJP2)的腺病毒。注
11、射后7天分離成年小鼠心肌細(xì)胞。
12Western blot的方法測定注射腺病毒成年小鼠心臟JP2蛋白表達(dá),并檢測對SK2通道蛋白表達(dá)的影響。
13.鈣瞬變的測定:將Ad-NC和Ad-siJP2組成年小鼠心肌細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度復(fù)鈣,并加入終濃度為2μM的Fura-2/AM,用1HZ場刺激誘發(fā)鈣瞬變,采用IonOptix心肌細(xì)胞收縮及離子濃度同步測量系統(tǒng)測量鈣瞬變,數(shù)據(jù)采用美國IonOptix公司的IonWizard6.
12、6軟件進(jìn)行分析。
14.Western blot的方法測定RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2鈣處理相關(guān)蛋白的表達(dá)。
15.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。以配對t檢驗(yàn)或單因素方差分析(one-way AN OVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)分析以P<0.05為有顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.Western blot檢測顯示肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白中有SK
13、2、JP2和RyR2三種蛋白的表達(dá)。
2.在心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白中加入JP2抗體(免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)組)或鼠源無關(guān)的抗-IgG抗體(陰性對照組)制備質(zhì)譜分析樣品,電泳后考馬斯亮藍(lán)染色,觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)泳帶,選出13條差異目標(biāo)條帶。質(zhì)譜分析后得到35013個(gè)與JP2可能有相互作用的蛋白質(zhì),最終篩選出90個(gè)相關(guān)的蛋白質(zhì),其中包括SK2和RyR2蛋白。通過信息分析學(xué)進(jìn)一步對蛋白質(zhì)進(jìn)行分類,并測定它們之間的相互作用。
14、3.String網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示JP2和RyR2兩者的直系同源蛋白可以在其他物種中共表達(dá),可以預(yù)測它們之間可能存在相互作用;由于目前只能同源模建出小鼠SK2的CaM區(qū)(序列為655-785),不能預(yù)測SK2和JP2之間是否有相互作用;但通過Western blot的方法用特異性SK2和RyR2抗體檢測到肌質(zhì)網(wǎng)小泡裂解液中JP2可以沉淀SK2和RyR2蛋白。
4.GST-JP2融合蛋白可以pull-down心肌組織裂解液中的SK
15、2,提示GST-JP2與心肌中SK2有相互作用,并且這種相互作用主要發(fā)生在JP2氨基末端的MORN區(qū),尤其是GST-JP2-N1(aa1-253)片段作用明顯,而GST-JP2的羧基末端GST-JP2-C片段(aa340-696)可以和心肌組織裂解液中的RyR2結(jié)合;體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GST-JP2的MORN1區(qū)1-253片段可以和HEK293細(xì)胞裂解液中的SK2蛋白結(jié)合。
5.將HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染SK2和JP2質(zhì)粒,用特異
16、性JP2或SK2抗體孵育細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SK2可以共沉淀JP2,JP2可以和SK2結(jié)合,提示體外JP2和SK2之間可能有相互作用。
6.成年小鼠尾靜脈注射陰性對照siRNA或JP2-siRNA的腺病毒,Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組(Ctrl-NT)和陰性對照組(Ad-NC)相比,Ad-siJP2組JP2表達(dá)減少到了47%和48%,而SK2通道蛋白表達(dá)無明顯變化。
7.成年小
17、鼠心肌細(xì)胞JP2敲減后,用IonOptix心肌細(xì)胞收縮及離子濃度同步測量系統(tǒng)測量鈣瞬變,與Ad-NC相比,Ad-siJP2組鈣瞬變的幅度顯著減少,鈣瞬變到達(dá)峰值50%的時(shí)間卻顯著增加,而細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+水平和鈣瞬變衰減50%的時(shí)間沒有顯著變化。使用Caffine測量RyR2依賴性肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲存水平,與陰性對照組相比,鈣瞬變的幅度亦顯著減少。因此,敲減成年小鼠心肌JP2的表達(dá),會減少心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放。
8.用Wes
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測SK2通道和RyR2的相互作用.pdf
- Junctophilin2對SK2通道表面膜表達(dá)的影響.pdf
- 1632.junctophilin2對小鼠心肌細(xì)胞sk2通道與ryr2功能耦聯(lián)的影響
- 近江牡蠣類立克次體與宿主相互作用的分子生物學(xué)研究.pdf
- 分子生物學(xué)的研究方法-dna-蛋白質(zhì)相互作用
- 心肌細(xì)胞鈉通道分子生物學(xué)和藥理學(xué)及刺槐素對SK通道的抑制作用研究.pdf
- 分子生物學(xué)
- 分子生物學(xué)習(xí)題2
- 分子生物學(xué)與臨床
- 分子生物學(xué)練習(xí)2-1答案
- 分子生物學(xué)講義
- 分子生物學(xué)論文
- 基礎(chǔ)分子生物學(xué)
- 分子生物學(xué)試卷
- hbv分子生物學(xué)
- 分子生物學(xué)考題
- 分子生物學(xué)總結(jié)
- 分子生物學(xué)題
- 分子生物學(xué)題庫
- 《分子生物學(xué)b》
評論
0/150
提交評論