酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)SK2通道和RyR2的相互作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 小電導(dǎo)Ca2+激活K+通道(Small-conductance calcium-activated potassiumchannal)有四種不同的亞型,分別是SK1、SK2、SK3和SK4通道。其中SK2主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),例如海馬CA1錐體細(xì)胞,外周組織也有表達(dá),例如人和小鼠的心肌、平滑肌組織。SK2是唯有通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道,其鈣源主要來(lái)自L-型Ca2+通道,部分來(lái)自肌漿網(wǎng)ryanod

2、ine receptors(RyRs)的Ca2+釋放通道。研究證明,SK2對(duì)蜂毒明肽(apamin)比較敏感,它參與了動(dòng)作電位的后復(fù)極化(after hyperpolarization,AHP)的形成,對(duì)調(diào)節(jié)突觸后電位的形成長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)的閾值以及突觸的可塑性有重要意義,對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和記憶方面也起到一定的作用。
　　 受體RyRs是存在于真核生物細(xì)胞肌漿網(wǎng)(Sarco

3、plasm icreticμlum,SR)上的一種細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放通道,現(xiàn)在哺乳類動(dòng)物的組織中已鑒定出RyR的3種亞型,分別是RyR1(ryanodine receptor type1),RyR2(ryanodine receptor type2)和RyR3(ryanodine receptor type3)。RyR2主要存在于心肌細(xì)胞,位于細(xì)胞的肌漿網(wǎng)上。RyR是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的通道,通過(guò)釋放SR內(nèi)的Ca2+來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2

4、+濃度。主要作用機(jī)制是鈣離子誘導(dǎo)的鈣離子釋放(Ca2+induced Ca2+release,CICR),為骨骼肌和心肌收縮提供肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+。直接參與心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程,RyR2的激活可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子迅速增加,其Ca2+濃度可快速增高10倍以上。
　　 上述提示,RyR2的激活可使大量的Ca2+從肌漿網(wǎng)釋放出來(lái)即Ca2+誘導(dǎo)Ca2+釋放(CICR),而SK2又是Ca2+依賴型的鉀通道,其激活依賴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增高,

5、另SK2和RyR2功能異常均可引起心肌功能的變化,如心率失常等。由此推測(cè),SK2和RyR2在心肌中可能存在著一定的功能聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)室的研究已表明心肌SK2通道與RyR2可形成免疫復(fù)合物,但是否存在直接相互作用,尚不明了。故本研究采用酵母雙雜交的方法進(jìn)一步檢測(cè)兩者之間是否存在分子相互作用的位點(diǎn)。對(duì)于深入研究?jī)傻鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性將有積極作用,并為揭示兩者與心臟功能的關(guān)系探索一條新的途徑。
　　 方法：
　　 1.目的基

6、因擴(kuò)增:構(gòu)建SK2和RyR2的cDNA文庫(kù),根據(jù)文庫(kù)質(zhì)粒基因序列和載體質(zhì)粒特點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成引物。PCR擴(kuò)增SK2和RyR2目的基因片段,瓊脂糖凝膠鑒定并回收。
　　 2.SK2-T和RyR2-T克隆構(gòu)建:SK2的目的基因與T載體連接,選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),PCR鑒定,提取SK2-T重組質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切SK2-T重組質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠鑒定,回收目的基因片段,測(cè)序鑒定。重組RyR2-T質(zhì)粒構(gòu)建同SK2-T。
　　 3.pGBKT7-SK

7、2和pGADT7-RyR2重組質(zhì)粒的構(gòu)建:SK2-T雙酶切純化的目的基因插入雙酶切純化的pGBKT7載體質(zhì)粒,構(gòu)建重組pGBKT7-SK2質(zhì)粒。選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),PCR鑒定,提取pGBKT7-SK2重組質(zhì)粒,雙酶切pGBKT7-SK2重組質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠鑒定,回收目的基因片段、測(cè)序鑒定。重組pGADT7-RyR2質(zhì)粒構(gòu)建同pGBKT7-SK2。
　　 4.轉(zhuǎn)化酵母菌:pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2電轉(zhuǎn)化酵母菌。酵母菌

8、AH109用YPDA培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)。用電轉(zhuǎn)化方法將pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基培養(yǎng),用雙營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基做自身激活檢測(cè)；將pGBKT7-SK2的3個(gè)重組質(zhì)粒分別與pGADT7-RyR2的16個(gè)重組質(zhì)粒兩兩配對(duì),共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109。根據(jù)酵母菌有無(wú)生長(zhǎng)和藍(lán)白顯色鑒定雙雜交結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR擴(kuò)增3個(gè)SK2目的基因片段和16個(gè)RyR2目的

9、基因片段,凝膠電泳可見(jiàn)相應(yīng)大小bp處有明亮條帶,與預(yù)期設(shè)計(jì)相符。
　　 2.成功構(gòu)建了含目的基因片段的SK2-T和RyR2-T重組質(zhì)粒。
　　 3.成功構(gòu)建了pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重組質(zhì)粒,SK2目的基因與pGBKT7載體連接、RyR2與pGADT7連接。經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 4.3個(gè)pGBKT7-SK2和16個(gè)pGADT7-RyR2重組子分別轉(zhuǎn)化酵母菌A

10、H109,經(jīng)鑒定pGBKT7-SK2與pGADT7-RyR2可轉(zhuǎn)入酵母菌AH109,且無(wú)自身激活。
　　 5.pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,無(wú)陽(yáng)性藍(lán)色菌落生長(zhǎng),提示SK2蛋白與RyR2蛋白片段間無(wú)直接相互作用。
　　 小結(jié):
　　 1.擴(kuò)增出3個(gè)SK2目的基因片段和16個(gè)RyR2目的基因片段,并成功構(gòu)建了pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2重組質(zhì)粒。
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