酵母雙雜交系統(tǒng)檢測SK2通道和RyR2的相互作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 小電導Ca2+激活K+通道(Small-conductance calcium-activated potassiumchannal)有四種不同的亞型,分別是SK1、SK2、SK3和SK4通道。其中SK2主要存在于中樞神經系統(tǒng),例如海馬CA1錐體細胞,外周組織也有表達,例如人和小鼠的心肌、平滑肌組織。SK2是唯有通過細胞內Ca2+激活的K+通道,其鈣源主要來自L-型Ca2+通道,部分來自肌漿網ryanod

2、ine receptors(RyRs)的Ca2+釋放通道。研究證明,SK2對蜂毒明肽(apamin)比較敏感,它參與了動作電位的后復極化(after hyperpolarization,AHP)的形成,對調節(jié)突觸后電位的形成長時程增強(long-term potentiation,LTP)的閾值以及突觸的可塑性有重要意義,對于中樞神經系統(tǒng)的學習和記憶方面也起到一定的作用。
　　 受體RyRs是存在于真核生物細胞肌漿網(Sarco

3、plasm icreticμlum,SR)上的一種細胞內Ca2+釋放通道,現在哺乳類動物的組織中已鑒定出RyR的3種亞型,分別是RyR1(ryanodine receptor type1),RyR2(ryanodine receptor type2)和RyR3(ryanodine receptor type3)。RyR2主要存在于心肌細胞,位于細胞的肌漿網上。RyR是細胞內Ca2+釋放的通道,通過釋放SR內的Ca2+來調節(jié)細胞內的Ca2

4、+濃度。主要作用機制是鈣離子誘導的鈣離子釋放(Ca2+induced Ca2+release,CICR),為骨骼肌和心肌收縮提供肌質網Ca2+。直接參與心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過程,RyR2的激活可使細胞內鈣離子迅速增加,其Ca2+濃度可快速增高10倍以上。
　　 上述提示,RyR2的激活可使大量的Ca2+從肌漿網釋放出來即Ca2+誘導Ca2+釋放(CICR),而SK2又是Ca2+依賴型的鉀通道,其激活依賴細胞內Ca2+濃度的增高,

5、另SK2和RyR2功能異常均可引起心肌功能的變化,如心率失常等。由此推測,SK2和RyR2在心肌中可能存在著一定的功能聯(lián)系。本實驗室的研究已表明心肌SK2通道與RyR2可形成免疫復合物,但是否存在直接相互作用,尚不明了。故本研究采用酵母雙雜交的方法進一步檢測兩者之間是否存在分子相互作用的位點。對于深入研究兩蛋白的結構和功能的相關性將有積極作用,并為揭示兩者與心臟功能的關系探索一條新的途徑。
　　 方法：
　　 1.目的基

6、因擴增:構建SK2和RyR2的cDNA文庫,根據文庫質?；蛐蛄泻洼d體質粒特點設計并合成引物。PCR擴增SK2和RyR2目的基因片段,瓊脂糖凝膠鑒定并回收。
　　 2.SK2-T和RyR2-T克隆構建:SK2的目的基因與T載體連接,選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),PCR鑒定,提取SK2-T重組質粒。經雙酶切SK2-T重組質粒,瓊脂糖凝膠鑒定,回收目的基因片段,測序鑒定。重組RyR2-T質粒構建同SK2-T。
　　 3.pGBKT7-SK

7、2和pGADT7-RyR2重組質粒的構建:SK2-T雙酶切純化的目的基因插入雙酶切純化的pGBKT7載體質粒,構建重組pGBKT7-SK2質粒。選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),PCR鑒定,提取pGBKT7-SK2重組質粒,雙酶切pGBKT7-SK2重組質粒,瓊脂糖凝膠鑒定,回收目的基因片段、測序鑒定。重組pGADT7-RyR2質粒構建同pGBKT7-SK2。
　　 4.轉化酵母菌:pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2電轉化酵母菌。酵母菌

8、AH109用YPDA培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)。用電轉化方法將pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重組質粒分別轉化酵母菌AH109,營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基培養(yǎng),用雙營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基做自身激活檢測；將pGBKT7-SK2的3個重組質粒分別與pGADT7-RyR2的16個重組質粒兩兩配對,共轉化酵母菌AH109。根據酵母菌有無生長和藍白顯色鑒定雙雜交結果。
　　 結果：
　　 1.PCR擴增3個SK2目的基因片段和16個RyR2目的

9、基因片段,凝膠電泳可見相應大小bp處有明亮條帶,與預期設計相符。
　　 2.成功構建了含目的基因片段的SK2-T和RyR2-T重組質粒。
　　 3.成功構建了pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重組質粒,SK2目的基因與pGBKT7載體連接、RyR2與pGADT7連接。經雙酶切及測序鑒定重組質粒,證明重組質粒構建正確。
　　 4.3個pGBKT7-SK2和16個pGADT7-RyR2重組子分別轉化酵母菌A

10、H109,經鑒定pGBKT7-SK2與pGADT7-RyR2可轉入酵母菌AH109,且無自身激活。
　　 5.pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2共轉化酵母菌AH109,無陽性藍色菌落生長,提示SK2蛋白與RyR2蛋白片段間無直接相互作用。
　　 小結:
　　 1.擴增出3個SK2目的基因片段和16個RyR2目的基因片段,并成功構建了pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2重組質粒。
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