甘藍SCR、THL與SRK交替相互作用的酵母雙雜交檢測.pdf

1、植物的自交不親和性(self-incompatibility,SI)是為了避免白花受精而進化出的重要遺傳機制。甘藍SI的分子過程是由存在于花粉中的S-位點富含半胱氨酸蛋白(S-locuscystein-richprotein,SCR)亦稱為S位點蛋白11(S-locusprotein11,SP11)識別結合柱頭上的S受體激酶基因(Sreceptorkinasegene,SRK)啟動,將原本結合于SRK上的負調控因子類硫氧還蛋白(Thio

2、redoxin-likeprotein,THL)釋放出來,然后通過目前尚未完全知曉的分子過程,實現自交不親和性。SRK(S位點受體激酶)、SCR/SP11(S位點富含半胱氨酸蛋白/S位點蛋白11)和THL1(類硫氧還蛋白)是甘藍自交不親和性信號傳導過程的重要的三個元件。本研究利用酵母雙雜交技術探討甘藍SCR、THL與SRK交替相互作用的關系。
　　 本研究利用PCR技術獲得兩種甘藍SCR2(classⅡ)、eSRg2(class

3、Ⅱ)、THL1、SRKJ(classⅠ,SRK6激酶域)和eSRKzs(classⅠ)的編碼序列,并分別構建以pGBKT7為載體的SCR2、THL1的重組“誘餌”質粒和以pGADT7為載體的eSRK2、eSRK28、SRKJ的重組“獵物”質粒。利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證eSRK2-SCR2,eSRK28-SCR2,SRKJ-THL1的相互作用。重組質粒在宿主細胞中未產生毒性及自激活作用,表明重組表達載體構建成功;試驗組合Y2HGold[pG

4、BKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]在三缺平板(SD/-Trp-Leu-His/x-a-gaFAbA,TDO/x/A)上生長出藍色克隆,激活了報告基因AUR1-C、MEL1、HIS3;實驗組合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]能夠在二缺平板(SD/-Trp-Leu)生長,但在三缺平板培養(yǎng)基上不生長,表明不同單倍型SRK-SCR可能不發(fā)生相互作用;實驗組Y187[pGAD

5、T7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]能夠在四缺平板培養(yǎng)基上生長,激活了4種報告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)。相同的單倍型SRK與SCR之間能夠相互作用,不同的單倍型之問不會發(fā)生相互作用;酵母中報告基因表達的數目和類型的差異所反映了classⅡ型內部的SCR-SRK和classⅠ的SCR-SRK互作強度,Ⅰ型高于Ⅱ型;THL與SRK之間存在較高的互作強度。這為Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不親和性表型所依

6、賴的三個起始信號傳導元件之間的識別程度差異提供了直接證據和新內容。主要研究結果總結如下:
　　 1.Ⅰ型和Ⅱ型的SCR2及eSRK2的基因克隆及序列分析
　　 擴增的eSRK2位于第一個外顯子的74bp～1321bp之間,編碼了416個氨基酸。VectorNTIAdvance分析Ⅰ和Ⅱ型的SRK氨基酸序列,發(fā)現classⅡ型的eSRK之間的相似性要高于classⅠ型。ClassⅡ型中的S-2、S-5和S-15之間的序列相

7、似性達到93%～97.3%;classⅠ型的S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之間氨基酸序列相似性比classⅡ型要低一些。比對分析發(fā)現Ⅰ和Ⅱ型的氨基酸序列在219～330的氨基酸區(qū)間和446～460的氨基酸區(qū)間呈現較大的差異,classⅠ型的氨基酸存在部分缺失。
　　 本研究擴增的是SCR2的第二個外顯子,共編碼65個氨基酸。應用VectorNTIAdvance分析不同的SCR氨基酸序列顯示了擬南芥

8、和甘藍氨基酸序列的趨異。在class-Ⅰ型中不同單倍型SCR氨基酸的相似度為20～76%;class-Ⅱ型中不同單倍型SCR蛋白質序列兩兩之間的相似度達到63～94%。Class-Ⅰ型SCR的4個半胱氨酸殘基高度保守,另外4個半胱氨酸殘基所處的位置略有差異;而class-Ⅱ型SCR的8個半胱氨酸殘基高度保守。
　　 2.誘餌蛋白毒性及其自激活檢測分析和pGADT7-SRK毒性檢測分析
　　 pGBKT7-SCR2質粒的菌

9、落出現在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal平板上為白色菌落;pGBKT7-THL1質粒在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal的平板上出現了生長狀態(tài)良好,菌斑與空載pGBKT7大小相近、菌斑密度均無明顯差異,證明轉入的表達蛋白對酵母無毒害作用。pGBKT7-SCRzpGBKT7-THL1在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上沒有菌落生長。pGBKT7-SCR:和pGBKT7-TH1質粒的酵母細胞中沒有激活報告

10、基因AUR1-C和MEL1,沒有發(fā)生自身的轉錄激活作用。
　　 pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2在SD/-Leu平板上生長狀態(tài)良好。而且其對照pGADT7斑點大小及生長時間與pGADT7-eSRK2pGADT7-SRKJ一致,說明表達蛋白對酵母菌無毒害作用。
　　 3.SCR2與eSRK2;eSRK28與SCR2;SRKJ與THL1相互作用檢測
　　 Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGo

11、ld[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]都能在DDO/x/A平板上長出明顯的藍色菌落,激活了報告基因AUR1-C和MEL1;Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]在DDO/x/A平板上未長出藍色菌落,初步判斷沒有相互作用。為更進一步檢測相互作用的可能性,排除假陽性和假陰性的出現;而后將DDO/x/A平板上的藍色克隆劃線至TDO

12、/x/A和QDO/x/A平板上,4天后發(fā)現涂有Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]的TDO/x/A在平板上呈藍色,而QDO/x/A平板上酵母菌株沒有生長的跡象,由此可表明報告基因HIS3也能被激活,而報告基因ADE未激活。而Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR28]×Y187[pGADT7-eSRK/s]在TDO/x/