CaMKII與L-型鈣通道在人心房肌SK2調(diào)控中的作用.pdf

1、目的：心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF,簡(jiǎn)稱房顫)是最常見的心律失常之一,是由心房主導(dǎo)折返環(huán)引發(fā)多個(gè)小折返環(huán)導(dǎo)致的房律紊亂。AF幾乎見于所有的器質(zhì)性心臟病與部分非器質(zhì)性心臟病,并引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥,如心力衰竭和動(dòng)脈栓塞等。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small conductance calcium-activated potassium channel, SK channel)在心血管系統(tǒng)主要分布于心房肌細(xì)胞,其中以SK2亞

2、型為主。SK2通道開放引起的K+外流在心肌細(xì)胞膜復(fù)極過程中具有重要作用。鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)是真核生物細(xì)胞中的胞質(zhì)蛋白,是 SK2通道的亞單位之一,它通過與Ca2+及SK2通道上CaM結(jié)合區(qū)域(calmodulin bind domain,CaMBD)結(jié)合后對(duì)SK2通道進(jìn)行調(diào)控。在AF狀態(tài)下,SK2通道功能發(fā)生何種改變、CaM對(duì)SK2通道的作用機(jī)制是否發(fā)生改變尚不清楚;鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Ca2+/calmod

3、ulin-dependent protein kinase,CaMK)是CaM作用于蛋白的介質(zhì),CaMK對(duì) SK2通道功能是否有調(diào)節(jié)作用也鮮有報(bào)道,深入討論這些問題對(duì)揭示AF的病理生理機(jī)制與防治有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察AF患者心房肌細(xì)胞SK2通道電流的改變以及CaMK對(duì)SK2通道的調(diào)控,為探討AF發(fā)生機(jī)制與防治方法提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究人心房肌SK2通道電流變化:23例接受心胸外科體外循

4、環(huán)手術(shù)患者分為兩組:心房顫動(dòng)組(atrial fibrillation,AF)9例,竇性心律組(Sinus rhythm, SR)14例。取患者手術(shù)過程中切除的右心耳組織,保存于氧飽和Cardioplegic液中,剪為1×1 mm3組織塊,置于酶液中進(jìn)行兩步消化。選取貼壁良好,折光性強(qiáng),具有立體感,表面光滑的心房肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞置于浴液中,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄電流,階躍方波脈沖方案:保持電位(holding potential

5、,HP):-60 mV,從-130 mV以10 mV階躍除極至+60mV,脈沖時(shí)程200 ms。電流信號(hào)通過膜片鉗放大器(Axopatch200B)放大,濾波器處理后(1 KHz)輸入計(jì)算機(jī),經(jīng)Clampex10.1軟件采集電流,Clampfit10.1軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)觀察和比較CaMKII特異性阻斷劑KN-93和L-型鈣通道特異性阻斷劑維拉帕米(verapamil)對(duì)SK2通道的影響。結(jié)果：⑴急性酶分離的心房肌細(xì)胞 SK2通

6、道電流的基本特性:①全細(xì)胞膜片記錄模式,記錄到心房肌細(xì)胞混合電流,其I-V曲線上隨細(xì)胞膜電位增加電流逐漸偏離(低于)歐姆定律的線性關(guān)系,呈現(xiàn)出內(nèi)向整流特征。②SR組與 AF組內(nèi)向整流混合電流密度分別為14.05±2.56 pA/pF(-130 mV,n=11)、43.05±28.93 pA/pF(-130 mV,n=6),P<0.01,兩組電流密度有差異。③SK2通道特異性阻斷劑 Apamin(1×10-7 mol/L)在20 min左

7、右可以明顯抑制實(shí)驗(yàn)條件引出的內(nèi)向整流混合電流,加入Apamin前后電流密度分別為11.92±6.21 pA/pF、8.20±4.33 pA/pF(-130mV,n=6),即抑制31.51％±4.98,P<0.01,有明顯差異。說明在本實(shí)驗(yàn)條件下可記錄到 SK2通道電流,其電流密度為加入 Apamin前后的差值。SK2通道I-V曲線表明該電流呈現(xiàn)內(nèi)向整流特征。④SR組與AF組SK2通道電流密度分別為3.67±0.37 pA/pF(-130

8、 mV,n=9)、9.81±2.54 pA/pF(-130 mV,n=9),P<0.01,兩組電流密度有明顯差異。⑵KN-93對(duì)人心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流混合電流的影響:①全細(xì)胞膜片記錄模式,KN-93(1×10-6 mol/L)在30 min左右可以明顯抑制實(shí)驗(yàn)條件引出的內(nèi)向整流混合電流,加入 KN-93前后電流密度分別為17.25±8.06 pA/pF、11.68±6.19 pA/pF(-130 mV,n=4), P<0.05,電流密度有

9、差異。②細(xì)胞經(jīng) KN-93預(yù)處理30 min,加入Apamin電流抑制2.83％±7.72(-130 mV,n=3);細(xì)胞未經(jīng)KN-93預(yù)處理,加入Apamin電流抑制31.51％±4.98(-130 mV,n=6),P<0.01,兩組Apamin抑制作用有明顯差異,說明KN-93可降低SK2通道對(duì)Apamin的敏感性。③SR組與AF組加入KN-93后,KN-93對(duì)心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流混合電流抑制分別為33.63％±13.84(-130

10、mV,n=5)、44.73％±28.19(-130 mV,n=4),P<0.01,兩組KN-93的抑制作用有明顯差異。⑶Verapamil對(duì) SK2通道的影響：①細(xì)胞經(jīng) Verapamil(1×10-5mol/L)預(yù)處理10 min,加入 Apamin電流抑制2.37％±3.14(-130 mV,n=4);細(xì)胞未經(jīng)Verapamil預(yù)處理,加入Apamin電流抑制31.51％±4.98(-130 mV,n=6),P<0.01,兩Apam

11、in抑制作用有明顯差異。②細(xì)胞經(jīng)Verapamil預(yù)處理10 min,加入Apamin前后電流密度為16.76±5.66 pA/pF(-130 mV, n=4)、16.68±5.01 pA/pF(-130 mV,n=4),P>0.05,電流密度無差異。以上兩結(jié)果說明Verapamil可降低SK2通道對(duì)Apamin的敏感性。結(jié)論：⑴急性酶分離人心房肌細(xì)胞上可檢測(cè) SK2通道電流,其基本特征為:具有內(nèi)向整流性質(zhì);SR組SK2通道電流密度低于