大鼠海馬L-型鈣通道相互作用蛋白在短暫性前腦缺血后的改變.pdf

1、腦中風(fēng)是當(dāng)今第三大死亡原因及首位致殘原因，腦中風(fēng)后的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡是由于腦組織缺血缺氧所致，而目前對缺血性腦損傷的機制仍未闡明，臨床也無理想的治療手段。L-型電壓敏感性鈣通道在海馬錐體神經(jīng)元的樹突和胞體都特別集中，通過L-型鈣通道的電流占細(xì)胞總體鈣電流的30-50％。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上，給予L-型鈣通道特異性阻斷劑可直接誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，而給予激動劑Bay K 8644則可以對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。此外，L-型鈣通道能將鈣調(diào)信號

2、直接傳至細(xì)胞核，激活核內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，如c-Fos，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和Bcl-2等，而這些基因?qū)ι窠?jīng)元的功能和存活都具有重要意義。上述結(jié)果都說明，L-型鈣通道功能改變可能在腦缺血后海馬神經(jīng)元死亡過程中發(fā)揮了重要的作用，然而其參與缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡的機制目前仍不清楚。 L-型鈣通道介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，引起胞內(nèi)鈣信號的變化從而調(diào)節(jié)細(xì)胞

3、功能和活動，但其作為電信號和化學(xué)信號的整合蛋白，直接的蛋白-蛋白相互作用也可能對通道活性及細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，而目前對此研究不多，尤其是在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中其下游分子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。目前已經(jīng)報道有許多蛋白激酶和磷酸酶可以直接作用于L-型鈣通道，如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)、酪氨酸激

4、酶Src等。鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)與Ca<'2+>結(jié)合蛋白CABP1(calciumbinding protein 1)也可以競爭性的與L-型鈣通道α<,1C>亞基C末端相結(jié)合。此外，PDZ[postsynaptic density-95(PSD-95)/Discs large/zona occludens-1(ZO-1)]蛋白shank、NIL-16(neuronal interleukin-16)以及其它一些蛋白，

5、如突觸蛋白RIM(rabinteracting molecular)、可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白sorcin、endophilin等也被發(fā)現(xiàn)可以與L-型鈣通道直接相互作用，影響突觸傳遞及調(diào)節(jié)通道間聯(lián)系等。但目前尚未有關(guān)于L-型鈣通道相互作用蛋白參與神經(jīng)細(xì)胞死亡過程的報道。因此，本實驗利用L-型鈣通道α<,1C>亞基的C末端為誘餌，通過GST-pull down的方法研究與L-型鈣通道相互作用蛋白在大鼠前腦缺血前后的變化，試圖尋找缺血性神經(jīng)

6、細(xì)胞死亡中L-型鈣通道可能的下游信號分子及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 首先，我們根據(jù)GenBank登錄的α<,1C>基因的編碼核苷酸序列，設(shè)計合成針對其C末端(1808-2139)編碼序列的一對特異性引物，從pcDNA3/α<,1C>質(zhì)粒上PCR擴增出其C末端基因，插入谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)融合表達(dá)載體pGEX-KG中，構(gòu)建了含L-型鈣通道α<,1C>亞基C末端編碼序列的pGEX-KG/

7、α<,1C>融合蛋白表達(dá)載體，經(jīng)BamHl和HindⅢ雙酶切后可見約1，000 bp、5,000 bp大小的兩個片段，與預(yù)期結(jié)果一致，測序結(jié)果表明序列正確。 然后，在原核細(xì)胞E.coli BL21中誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)，在異丙基-β-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)的誘導(dǎo)下，重組菌表達(dá)出一個分子量約為70 KD的表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot結(jié)果證實，重組GST融合蛋白

8、可與抗GST抗體及針對α<,1C>亞基C末端的抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)，表明表達(dá)的蛋白為預(yù)期的融合蛋白。利用谷胱苷肽瓊脂糖珠純化GST-α<,1C>重組蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，重組質(zhì)粒分別在70 KD、40 KD、30 KD左右出現(xiàn)三條蛋白條帶，用抗α<,1C>一抗，羊抗兔為二抗，進(jìn)行Western blot驗證，三條帶均呈陽性，可能GST-α<,1C>融合蛋白在純化過程中發(fā)生了降解。 最后，采用改良的Pulsinelli

9、四血管閉塞法制做大鼠全腦缺血模型，在缺血再灌流24小時后，提取海馬組織蛋白分別與純化后固定于谷胱苷肽瓊脂糖珠的GST-α<,1C>、GST蛋白共同孵育，洗脫后經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)缺血組與假手術(shù)組相比可見三條差異條帶。其中兩條在缺血后與L-型鈣通道結(jié)合減少，一條與L-型鈣通道結(jié)合增加，說明在大鼠海馬組織中存在與α<,1C>亞基C末端片斷相互作用的蛋白，且部分與L-型鈣通道結(jié)合的蛋白在缺血過程中發(fā)生了變化，因此，這些發(fā)生變化的蛋白與