成年大鼠海馬神經前體細胞表達功能性的L-型鈣通道.pdf

1、成年哺乳動物大腦可以產生新的神經元，這一發(fā)現(xiàn)是神經科學領域的重大突破。非常有趣的是這種腦結構可塑性的新模式僅發(fā)生在一些離散的腦區(qū)，目前大多數(shù)的研究者都把目光聚焦在腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬結構中的齒狀回(dentate gyms，DG)。在過去的二十年問，該領域主要有兩個研究方向：1)神經干細胞樣細胞(和它們的子代細胞)的生物學特性和新生神經元如何整合到已存在的神經網絡中；2)這些新生神經元在腦功能

2、中的作用。方法學問題阻礙了這個領域的發(fā)展，但是也取得了相當大的進展。目前人們發(fā)現(xiàn)細胞內在機制和外在因子共同參與了成年神經再生的調節(jié)，而且環(huán)境和生理狀況也可以影響神經再生，另外，神經再生也參與了一些腦疾病的病理過程。 目前人們大多使用BrdU來研究體內的神經再生。雖然用BrdU有很多優(yōu)點，但是也存在不少缺點。因此，研究成年神經再生必須先從細胞(分子)水平開始，然后結合在體研究，從而提高研究結果的可靠性。而其中一個前提條件就是需要建

3、立神經前體細胞的體外培養(yǎng)技術平臺。 成年大鼠神經前體細胞的體外培養(yǎng)一直以來是一件比較棘手的事情。目前國際上培養(yǎng)成年神經前體細胞有兩種方法：懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)目前還存在爭議，一部分學者認為懸浮生長的細胞克隆并非神經球。貼壁培養(yǎng)國際上僅Gage小組一家，同時也是目前被廣為認可的培養(yǎng)方法。國內也一直沒有實驗室報導過用貼壁法培養(yǎng)成年大鼠的海馬神經前體細胞。 L-型鈣通道在神經發(fā)育過程中具有重要作用，并且有報道電壓依賴性

4、鈣通道 參與了胚胎HPCs向神經元分化的調控。但在成年的HPCs上是否表達L-型鈣通道目前尚未見報道。 本研究的目的是在參照Gage's方法的基礎上建立一種能夠獲得高純度成年Wistar大鼠海馬神經前體細胞(HPCs)的體外貼壁培養(yǎng)方法，并鑒定HPCs上是否存在功能性L-型鈣通道。 本實驗取Wistar成年雌性大鼠海馬組織，制成單細胞懸液，利用無血清培養(yǎng)技術，在添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、

5、N-2和B27supplement的DMEM/F12培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)，前三代細胞形態(tài)主要呈多角型有粗大突起，似星形膠質細胞，部分細胞呈圓形，有的呈分裂相。第四代時一種體積較小、呈圓形、周圍長有細小突起的細胞逐步代替了原來的細胞。Alvarez-Buylla和Kaplan and Bell研究證實，成年哺乳動物海馬存在兩種神經前體細胞，一種細胞相當于SVZ中的B細胞，表達GFAP；另一種細胞由B細胞產生，體積較B細胞

6、小，稱為D細胞。以上表明我們體外培養(yǎng)的結果與上述報導是一致的。前四代細胞以B細胞為主，隨著傳代的進行B細胞逐漸生成了D細胞。采用細胞免疫熒光法對原代和第六代細胞分別進行鑒定，呈巢蛋白(Nestin)陽性的細胞分別達66.7％和99.9％。 在細胞培養(yǎng)液中加入5μmol/L的BrdU，作用24小時，BrdU與nestin免疫熒光雙標發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細胞都同時表達這兩種抗原，說明細胞處于活躍的分裂增殖期。 把培養(yǎng)的高純度的細胞在分化培養(yǎng)基

7、中誘導分化，分化第五天細胞就表現(xiàn)為神經元、星形膠質和少突膠質細胞的形態(tài)，分化第14天細胞免疫熒光分別呈Ⅲ型β-微管蛋白(Tujl)陽性和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性。細胞來源于成年神經組織的未分化細胞、具有自我復制能力、可分化為神經元和膠質細胞，表明所培養(yǎng)的細胞為神經前體細胞。 細胞免疫熒光和免疫印跡結果顯示HPCs表達L-型鈣通道的Cavl.2a<,1>C和Cavl.3a<,1>D亞單位。 共聚焦鈣成像證明了HPCs上存在功

8、能性L-型鈣通道。首先我們在細胞外液中加入20mmol/L的KCl后，觀察到熒光強度顯著增強(F/FO=1.17±0.03，p<0.001，n=37)，表明去極化可誘導細胞內[Ca<'2+>]<,i>增加。洗去KCl加入L-型鈣通道特異性阻斷劑Nifedipine(10μmol／L)，這時熒光強度略有降低(p<0.05)，稍后再加入KCl，同一視野相同細胞上未見熒光強度的顯著增強(F／FO=1.03±0.02，p>0.05)。用Nife

9、dipine的溶劑乙醇(1‰)處理HPCs，KCl仍可誘導熒光強度顯著增強(F／FO=1.43±0.06，p<0.001，n=10)，表明Nifedipine的作用不是乙醇所致。另外，在無鈣細胞外液中加入KCl后未見熒光強度的顯著增強(F／FO=1.01±0.01，p>0.05，n=10)。以上結果表明L-型鈣通道介導了KCl誘導的鈣離子內流。(F／FO均為加入KCl后第80秒)。進一步我們用全細胞膜片鉗技術記錄到了L-型鈣電流：當電壓

10、從-30 mV直接去極化到10 mV，平均電流為100 pA±2.35 pA；特異性的L-型鈣通道激動劑BayK8644(1μmol／L)使該電流顯著增加至150 pA±15.15 pA(n＝3)，與正常對照組比，差異顯著(P<0.05)；而1 μmol／L的特異性阻斷劑尼氟地平(Nifedipine)可明顯使該電流降低到正常對照組的65％左右(P<0.05)，10μmol／L尼氟地平幾乎完全抑制了該電流。 以上結果表明成年Wi