先天性靜止性夜盲大鼠視桿雙極細(xì)胞L-鈣通道電生理特征.pdf

1、先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness，CSNB)是一類先天性、非進(jìn)展性、以視網(wǎng)膜視桿信號(hào)系統(tǒng)功能障礙為主的眼科疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，且缺乏有效治療手段。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一種CSNB模式大鼠為編碼L-鈣通道的Cacna1f基因自然突變所致，主要影響視網(wǎng)膜視桿信號(hào)系統(tǒng)，電生理及行為學(xué)證明其克服了基因工程誘導(dǎo)模式動(dòng)物與臨床實(shí)際差異較大的缺陷，因此可以作為研究CSNB發(fā)病機(jī)制及視網(wǎng)

2、膜信號(hào)回路之間關(guān)系的一種新模型。以往研究工作主要集中在視網(wǎng)膜第一級(jí)神經(jīng)元水平（視桿細(xì)胞），推測(cè)其發(fā)病機(jī)制為視桿細(xì)胞突觸末端膜鈣通道功能障礙，后者對(duì)含遞質(zhì)囊泡釋放產(chǎn)生影響，導(dǎo)致視覺信號(hào)傳導(dǎo)受限而發(fā)病。該通道在視桿雙極細(xì)胞（rod bipolar cells,RBCs）中也有表達(dá)，其在CSNB發(fā)病中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　鑒于雙極細(xì)胞在視覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及視桿與視錐回路間相互作用中起著非常重要的作用，本實(shí)驗(yàn)采用利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)

3、本實(shí)驗(yàn)室培育的CSNB大鼠RBCsL-鈣通道電生理學(xué)和通道藥理學(xué)特征進(jìn)行觀察，并探討其與視網(wǎng)膜視覺信號(hào)傳遞障礙之間的聯(lián)系。脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜有非常相似的解剖結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能，不同動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果種群變異性很小，因此研究CSNB鈣通道電流特征可為進(jìn)一步明確這種疾病的發(fā)病機(jī)制及采取針對(duì)性的視覺干預(yù)保護(hù)措施提供依據(jù)。
　　材料與方法：
　　實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室鑒定發(fā)現(xiàn)，并建立近交系的CSNB大鼠（F20/F21,4～8周齡）及正常同齡對(duì)照SD

4、大鼠，深度麻醉后處死大鼠摘取眼球，利用手動(dòng)切片機(jī)制作視網(wǎng)膜切片，在紅外干涉顯微成像系統(tǒng)中尋找RBCs胞體，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗模式記錄L-鈣通道電流；給細(xì)胞施加階躍刺激（從-60mV除極至0mV，時(shí)程200ms），記錄程序刺激后細(xì)胞靜息膜電容（restCm）的變化值（△Cm），并據(jù)此計(jì)算胞吐系數(shù)EI（Exocytotic index）；分別施加L-鈣通道阻斷劑nifedipine和GABA受體阻斷劑PTX來觀察通道的藥理學(xué)特征；用應(yīng)用Axo

5、n公司的pClamp8．1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量分析，獲取RBCsL-鈣通道電生理學(xué)指標(biāo)。在Clampfit上選取有代表性的實(shí)驗(yàn)記錄,導(dǎo)入到Origin軟件進(jìn)行分析和作圖。
　　結(jié)果：
　　1.RBCsL-鈣通道電流特征
　　給細(xì)胞施加階躍刺激和斜坡刺激后，在SD組和CSNB組大鼠的RBCs中均可記錄出內(nèi)向電流，其電生理學(xué)特征符合L-鈣通道電流特點(diǎn)：在較高除極電位激活；失活緩慢；載流離子為Ca2+:用同等濃度Mg2+代替灌流

6、液中的Ca2+，未能記錄到類似電流。
　　2.L-鈣通道藥理學(xué)特性
　　特異性L-鈣通道阻斷劑nifedipine（10μm）可以完全阻斷SD組和CSNB組所記錄的內(nèi)向電流。結(jié)合其電生理學(xué)特征我們可以判定本實(shí)驗(yàn)在RBCs所記錄到的內(nèi)向電流為L(zhǎng)型鈣通道電流。
　　3.SD大鼠與CSNB大鼠RBCsL-鈣通道電流比較
　　SD組大鼠RBCsL-鈣通道于-40mV左右開放，通道電流于-20和-30mV之間達(dá)到峰值：-3

7、3.2±2.5pA（n=20）。CSNB組大鼠RBCsL-鈣通道于-20mV和-30mV之間開始激活，通道電流于-15mV左右達(dá)峰，峰值為12.2±2.3pA(n=23)。
　　4.SD大鼠視網(wǎng)膜RBCs的負(fù)反饋電流
　　SD組較強(qiáng)程度除極（-20m和-30mv）時(shí)可在Ca2+電流上發(fā)現(xiàn)較小的外向的電流（n=11），電流大小與細(xì)胞在切片中的位置有關(guān)，位置越深外向電流越大。應(yīng)用GABAA和GABAC受體阻斷劑PTX（100μm

8、）能夠明顯阻斷這種外向電流，提示其為為RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流（inhibitorypostsynapticcurrent，IPSCS）。而在CSNB組所有記錄細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)此種外向電流。
　　5．SD大鼠與CSNB大鼠RBCs胞吐指數(shù)差異
　　給細(xì)胞施加階躍刺激（從-60mV除極至0mV，時(shí)程200ms），記錄程序刺激后restCm的變化值（△Cm）,并據(jù)此計(jì)算胞吐系數(shù)EI：SD組大

9、鼠restCm為：4146.600±544.202fF,△Cm為29.600±7.472fF，EI：0.723±0.199；CSNB組大鼠restCm為：4356.957±549.493，△Cm為12.348±6.919，EI為0.291±0.173。SD組大鼠△Cm較CSNB組大鼠高，EI較CSNB組大鼠大，有明顯差異（p<0.01）與對(duì)照組比較，CSNB大鼠的△Cm和EI明顯降低（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.實(shí)

10、驗(yàn)在CSNB組和SD組大鼠RBCs中所記錄的電流為L(zhǎng)-鈣通電流；CSNB組大鼠RBCsL-鈣通電流峰值明顯小于SD組大鼠，推測(cè)CSNB大鼠電流強(qiáng)度降低導(dǎo)致胞內(nèi)，尤其是突觸終末的Ca2+濃度降低,難以達(dá)到觸發(fā)正常速率神經(jīng)遞質(zhì)釋放所需要的濃度，因此可能會(huì)使突觸終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放發(fā)生障礙，從而影響視覺信號(hào)向下一級(jí)神經(jīng)元傳導(dǎo)。
　　2.CSNB組大鼠I-V曲線較SD組右移大約20mV，會(huì)導(dǎo)致通道在雙極細(xì)胞暗適應(yīng)生理電位范圍（-70mV—-2

11、0mV）內(nèi)難以除極化。
　　3.CSNB大鼠RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流（IPSCS）消失，提示其觸終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程發(fā)生障礙，難以觸發(fā)來自AⅡACs的負(fù)反饋。這種負(fù)反饋障礙會(huì)影響rod視覺信號(hào)局部突觸環(huán)路放大機(jī)制和視覺信號(hào)向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞傳導(dǎo)的可塑性。
　　4．CSNB大鼠胞吐系數(shù)EI明顯降低，說明CSNB組大鼠RBCs因?yàn)殁}內(nèi)流導(dǎo)致遞質(zhì)囊泡和細(xì)胞膜融合，使細(xì)胞膜表面積（胞吐系數(shù)）增加的程