哇巴因?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞鈣瞬變及收縮力的作用.pdf

1、Na+/K+-ATPase(NKA)即鈉泵,廣泛存在于人和動(dòng)物的各種組織細(xì)胞,其作用是消耗一分子ATP的同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入兩個(gè)K+,轉(zhuǎn)運(yùn)出三個(gè)Na+。到目前為止,發(fā)現(xiàn)鈉泵是由α、β、γ亞基組成的寡聚體。其中α亞基是催化亞基,存在離子、ATP和強(qiáng)心苷(cardiac glycosides,CGs)的結(jié)合位點(diǎn),主要執(zhí)行泵功能。已發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物至少存在4種α亞基(α1、α2、α3和α4亞單位)。
　　 以往的研究表明,雙氫哇巴因(deh

2、ydroouabain,DHO,一種CGs)增加心肌細(xì)胞舒張期鈣,而不改變鈣瞬變,但增加心肌收縮力。也有報(bào)道哇巴因(ouabain,OUA,一種CGs)既能增加心肌細(xì)胞鈣瞬變,也能增加心肌收縮力。本室研究提示毒毛旋花子苷元(strophanthidin,Str,一種CGs)能夠濃度依賴性增加心肌細(xì)胞鈣瞬變,伴隨鈣瞬變的增加心肌收縮力相應(yīng)增加。
　　 大鼠心肌細(xì)胞的Na+/K+-ATPase存有對(duì)強(qiáng)心苷高親和力的α2亞基和低親和力

3、α1亞基,以往研究表明3×10-7M OUA能夠抑制94％NKAα2亞基和1％α1亞基,3×10-4 M OUA能夠抑制90％NKAα1亞基。但不同的亞基的結(jié)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變、舒張期鈣和收縮力有何影響尚未見報(bào)道。
　　 本室的研究表明,相比于正常細(xì)胞Str能更大幅度增加降主動(dòng)脈結(jié)扎所致心衰細(xì)胞的收縮力,強(qiáng)心苷對(duì)其他類型心衰的作用未見報(bào)道。
　　 強(qiáng)心苷在10-1-10-3M范圍內(nèi)抑制NKA,在離體心臟上和心肌細(xì)胞上,較低

4、濃度表現(xiàn)為正性肌力作用,而高濃度出現(xiàn)心律失常;在10-10-10-8M范圍內(nèi)興奮NKA,在離體心臟上能夠表現(xiàn)正性肌力作用,但在心肌細(xì)胞上未見有正性肌力作用的報(bào)道。
　　 急性分離的大鼠心肌細(xì)胞常用于檢測(cè)細(xì)胞的收縮舒張功能,但其對(duì)細(xì)胞的質(zhì)量要求非常高,不僅需要持續(xù)的興奮性,而更要有穩(wěn)定的收縮。以往學(xué)者在消化酶、灌流液成分、pH值以及溫度等細(xì)胞分離條件進(jìn)行了大量的探索改進(jìn),但應(yīng)用常規(guī)的Langendorff裝置,由于酶解終點(diǎn)難以判斷

5、,僅靠經(jīng)驗(yàn)判斷酶解終點(diǎn)的主觀性強(qiáng),重復(fù)性差,難以得到狀態(tài)良好且功能穩(wěn)定的細(xì)胞,從而使細(xì)胞收縮舒張功能的測(cè)定效率降低。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過改進(jìn)傳統(tǒng)的Langendorff裝置,使分離的細(xì)胞狀態(tài)良好且功能穩(wěn)定。然后同步檢測(cè)OUA對(duì)正常和阿霉素所致心衰大鼠左心室肌細(xì)胞的鈣瞬變、舒張期鈣和收縮力變化,探討OUA分別抑制心肌細(xì)胞Na+/K+-ATPaseα1和α2對(duì)其所產(chǎn)生的影響。通過測(cè)定大鼠左心室肌不同分層的細(xì)胞對(duì)低濃度OUA的敏感性,

6、以來探討nM級(jí)濃度的強(qiáng)心苷在離體心臟和心肌細(xì)胞的上表現(xiàn)不一致的可能原因。
　　 第一部分大鼠心肌細(xì)胞分離方法的改進(jìn)
　　 目的:建立一種易于判斷酶解終點(diǎn)的分離大鼠心肌細(xì)胞的方法。
　　 方法:成年SD大鼠麻醉后開胸取出心臟,分別采用傳統(tǒng)的Langendorff灌流裝置和本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的Langendorff灌流裝置,于恒溫37℃灌流消化液(含0.6％膠原酶B,0.6％BSA,30μM Ca2+的臺(tái)氏液)分離細(xì)胞,并

7、采用IonOptix單細(xì)胞動(dòng)緣檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞功能。
　　 結(jié)果:傳統(tǒng)的Langendorff灌流裝置分離細(xì)胞,酶解終點(diǎn)難以判斷,每次分離的細(xì)胞質(zhì)量差別較大,且不耐鈣,收縮的穩(wěn)定性較差。而以改進(jìn)的Langendorff灌流裝置分離細(xì)胞易于確定消化終點(diǎn),細(xì)胞成活率大于80％,在含1.8mM Ca2+的臺(tái)氏液中存活率也高達(dá)50％。給予電壓15V、頻率1Hz、波寬4ms的持續(xù)電刺激時(shí),其在1000s內(nèi)收縮舒張功能穩(wěn)定。
　　

8、結(jié)論:經(jīng)改造的Langendorff灌流裝置分離的心肌細(xì)胞成活率高,可控性強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,明顯優(yōu)于采用傳統(tǒng)Langendorff灌流裝置分離的細(xì)胞。能夠更好地用于檢測(cè)細(xì)胞收縮舒張功能的實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分哇巴因?qū)π募〖?xì)胞鈣瞬變及收縮力的作用
　　 目的:通過檢測(cè)OUA對(duì)正常和阿霉素所致心衰大鼠左心室肌細(xì)胞的鈣瞬變、舒張期鈣和收縮力的影響,探討OUA分別抑制心肌細(xì)胞NKAα1和α2對(duì)其所產(chǎn)生的影響以及左心室肌不同部位細(xì)胞對(duì)

9、OUA的敏感性。
　　 方法:腹腔注射阿霉素制備大鼠心衰模型,以改良的Langendorff裝置分離心衰大鼠和正常大鼠心肌細(xì)胞,負(fù)載Fluo-4鈣熒光染料后采用IonOptix可視化細(xì)胞動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)(Video-based motion edge-detectionsystem)同步檢測(cè)OUA對(duì)心肌細(xì)胞收縮舒張功能、舒張期鈣及鈣瞬變的變化;并分別測(cè)定1nM對(duì)心肌內(nèi)膜、肌層、外膜細(xì)胞的收縮舒張功能。
　　 結(jié)果:
　

10、　 1腹腔注射阿霉素能致大鼠心衰
　　 腹腔注射阿霉素后大鼠精神萎靡不振,活動(dòng)、進(jìn)食減少,呼吸加快,體重明顯減輕。且心率、左室內(nèi)壓和±dp/dtmax明顯降低,左心室舒張末壓明顯升高。
　　 400倍光鏡下觀察顯示心肌細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核畸形,并且出現(xiàn)局部壞死。
　　 2 OUA對(duì)正常大鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變和收縮力的影響:
　　 10-7～10-3M OUA能夠濃度依賴性增加心肌細(xì)胞收縮力和鈣

11、瞬變:3×10-7M OUA即能顯著性增加心肌細(xì)胞的收縮力(58.00±27.86,P＜0.05)和鈣瞬變(27.38±14.47,P＜0.05),3×10-4 M OUA增加的心肌細(xì)胞收縮效應(yīng)為217.34±63.80％(P＜0.01),鈣瞬變?yōu)?0.95±15.81％(P＜0.05)。10-3MOUA在增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力的同時(shí),不僅能夠進(jìn)一步增加鈣瞬變,還能夠濃度依賴性增加心肌細(xì)胞舒張期鈣,但其所增強(qiáng)的心肌細(xì)胞收縮幅度與3×10-4

12、 M沒有顯著差別,且隨即引起細(xì)胞攣縮死亡,提示3×10-4 M為OUA能產(chǎn)生最大效應(yīng)的極量。
　　 10-5～10-3M OUA不僅能夠增加鈣瞬變,并且也能夠濃度依賴性增加心肌細(xì)胞舒張期鈣,而更低濃度的OUA對(duì)舒張期鈣無影響。
　　 10μM nimodipine能夠顯著降低心肌細(xì)胞的收縮幅度、舒張期鈣濃度和鈣瞬變,3×10-4 M OUA能夠翻轉(zhuǎn)nimodipine的上述作用。而3×10-7MOUA不能改變nimodi

13、pine所產(chǎn)生的抑制。
　　 3 OUA對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變和收縮力的影響:
　　 阿霉素所致心衰大鼠心肌細(xì)胞對(duì)OUA敏感度降低,3×10-7M OUA不能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮力,而3×10-4 M OUA雖仍能夠顯著性增強(qiáng)收縮力,但收縮幅度明顯小于對(duì)正常心肌細(xì)胞的收縮。3×10-4 M OUA對(duì)舒張期鈣和鈣瞬變?cè)黾拥姆纫嗟陀趯?duì)照組。
　　 4納摩爾OUA能夠增強(qiáng)心室內(nèi)膜細(xì)胞的收縮力
　　 1 nM

14、 OUA能夠增強(qiáng)心室肌細(xì)胞的收縮力,增加的收縮幅度為21.32±9.05％(P＜0.05,n=4),但有這種陽性反應(yīng)的細(xì)胞較少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在nM濃度下OUA對(duì)心肌不同部位細(xì)胞產(chǎn)生正性肌力作用的陽性率不同。其中心室內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)該濃度OUA的陽性率最高(4/6),基層細(xì)胞次之(1/4),心室外膜細(xì)胞未觀察到有陽性結(jié)果。提示心室內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)OUA更為敏感,nM OUA能夠增強(qiáng)心室內(nèi)膜細(xì)胞收縮力
　　 結(jié)論:10-7～10-3 M O