周期性牽張誘導(dǎo)膀胱逼尿肌細(xì)胞高表達(dá)Cx43的實驗研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌不穩(wěn)定(Detrusorinstability，DI)是一種常見的膀胱功能障礙，可引起尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等臨床癥狀，嚴(yán)重者還將引起腎、輸尿管積水和腎功能損害，嚴(yán)重影響人們的身體健康。DI的臨床發(fā)病率高，療效不理想，主要原因是其發(fā)生機(jī)理尚不清楚。 研究顯示，DI逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接(Gapjunction，GJ)顯著增加；縫隙連接蛋白表達(dá)以Connexin43(Cx43)增加為主。縫隙連接是相鄰細(xì)胞間電耦聯(lián)

2、的媒介及離子交換的低阻力膜通道，它允許分子量小于1.0-1.5KD或直徑小于1.0nm的小分子物質(zhì)如離子、第二信使、Ca2++、cAMP、cGMP等直接通過，使這些物質(zhì)能在相鄰細(xì)胞間快速傳遞。因此，縫隙連接增加可使小分子物質(zhì)容易通過縫隙連接在細(xì)胞間擴(kuò)散，從而導(dǎo)致逼尿肌細(xì)胞膜去極化，逼尿肌易發(fā)生收縮而導(dǎo)致逼尿肌不穩(wěn)定。但是目前尚不清楚促使Cx43高表達(dá)的機(jī)制。 綜合文獻(xiàn)資料，DI往往是由膀胱出口梗阻(Bladderoutletob

3、struction，BOO)引起的。但是，BOO是如何導(dǎo)致DI呢?其具體途徑不清楚。我們設(shè)想，膀胱出口梗阻導(dǎo)致膀胱代償性肥大、擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致功能的改變；那么，逼尿肌細(xì)胞受到周期性牽張刺激可能是DI發(fā)生的觸發(fā)器。而我們前期研究也已經(jīng)證實，運用周期性牽張逼尿肌細(xì)胞體外模型可以很好地模擬梗阻后膀胱過度膨脹狀態(tài)。因此，我們應(yīng)用該模型來探討周期性牽張刺激對膀胱逼尿肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的改變及其可能機(jī)制。 本課題主要從以下幾個方面對逼尿

4、肌細(xì)胞進(jìn)行研究。第一，建立周期性牽張膀胱逼尿肌細(xì)胞模型，并在此基礎(chǔ)上觀察牽張刺激對膀胱逼尿肌細(xì)胞連接蛋白Cx43表達(dá)的影響。第二，用EGTA鰲合細(xì)胞外游離Ca2+，觀察牽張誘導(dǎo)Cx43表達(dá)改變對Ca2+的依賴性。第三，牽張前用不同的鈣通道抑制劑抑制鈣通道，然后再予以牽張刺激，觀察逼尿肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的改變，探討Ca2+信號在牽張刺激誘導(dǎo)Cx43表達(dá)改變中的作用。 方法：采用膠原酶消化法常規(guī)分離培養(yǎng)S

5、D大鼠逼尿肌細(xì)胞，并將細(xì)胞接種在彈性底部的培養(yǎng)皿上，對其施加周期性張力負(fù)荷，建立起周期性牽張膀胱逼尿肌細(xì)胞體外模型。應(yīng)用半定量RT-PCR及WesternBlotting等方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測逼尿肌細(xì)胞連接蛋白Cx43基因及其蛋白的表達(dá)變化。采用激光共聚焦顯微鏡法，測定EGTA及不同鈣通道拮抗劑作用條件下，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改變，揭示不同的鈣通道在牽張刺激誘導(dǎo)Cx43表達(dá)改變中的作用。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下：

6、1.成功建立了周期性牽張膀胱逼尿肌細(xì)胞體外模型，為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)； 2.周期性牽張刺激可以誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞Cx43基因表達(dá)顯著增加，與正常對照組相比較有非常顯著性差異(P＜0.01)； 3.周期性牽張刺激可以誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)顯著增加，與正常對照組相比較具有非常顯著性差異(P＜0.01)； 4.牽張前用EGTA鰲合細(xì)胞外游離Ca2+，再給予細(xì)胞牽張刺激，則細(xì)胞Cx43mRNA表達(dá)與正常對照組比較無

7、明顯差異(P＞0.05)，與單純牽張組比較相差非常顯著(P＜0.01)； 5.牽張刺激可以顯著增加[Ca2+]i，EGTA可以完全抑制牽張誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加，氯化釓、硝苯地平、蘭尼堿與毒胡蘿卜素可分別抑制61.95％、29.98％、87.98％由牽張刺激誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加。 結(jié)論：主要結(jié)論如下： 1.周期性牽張逼尿肌細(xì)胞體外模型是模擬梗阻后膀胱過度擴(kuò)張狀態(tài)的有效的研究手段； 2.周期性牽張刺激

8、可以誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞Cx43在基因水平表達(dá)較正常對照組明顯增加； 3.周期性牽張刺激可以誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞Cx43在蛋白水平表達(dá)較正常對照組明顯增加； 4.梗阻后逼尿肌細(xì)胞受到的周期性牽張刺激可能是DI發(fā)生的觸發(fā)器； 5.牽張刺激誘導(dǎo)Cx43表達(dá)增加是Ca2+依賴性的，牽張誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流可能是這一反應(yīng)的初始刺激因素； 6.牽張激活離子通道在周期性牽張誘導(dǎo)膀胱逼尿肌細(xì)胞Cx43表達(dá)增加反應(yīng)中可能起著較