Cx43蛋白表達在腦血管痙攣細胞模型中的研究.pdf

1、目的：前期研究表明，縫隙連接在腦血管痙攣中發(fā)揮重要作用，本實驗進一步在細胞水平探討縫隙連接蛋白Cx43表達的改變及對其腦血管痙攣的影響。 方法：一、利用組織貼塊法原代培養(yǎng)的兔腦基底動脈平滑肌及血管成纖維細胞，用光學相差顯微鏡、免疫細胞化學染色鑒定。二、Cx43沉默病毒載體的建立；用pGC-Cx43-scilencer質(zhì)粒對JM109菌株進行轉(zhuǎn)化，然后采用質(zhì)粒DNA純化擴增系統(tǒng)對pGC—Cx43-scilencer質(zhì)粒進行鑒定及擴

2、增。質(zhì)粒交由生物公司合成Ad5-Cx43-shRNA-GFP載體。用該病毒對細胞進行感染，用熒光顯微鏡下觀察感染后的細胞GFP的表達及免疫細胞化學檢測感染效率.三、腦血管痙攣細胞模型的建立：分別建立Fujii細胞模型及我們首創(chuàng)的共培養(yǎng)細胞模型。四、對上述兩種模型分別用10-6M的OxyHb孵育24、48、72、96小時后用western blot及免疫細胞化學方法觀察Cx43蛋白的變化、HE染色后在光鏡下采用雙盲法觀察平滑肌細胞長度變化

3、。五、對Cx43進行RNAi干擾：其中Fujii細胞模型直接干擾平滑肌細胞，而立體共培養(yǎng)模型則只干擾血管成纖維細胞，觀察OxyHb誘導的Cx43蛋白的改變及對平滑肌長度的影響，記錄結(jié)果，均數(shù)±標準差，采用t檢驗，進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：一、1、培養(yǎng)的動脈平滑肌細胞的鑒定： 1)、在相差倒置光學顯微鏡下觀察，1周左右可見有細胞自組織塊周邊游出，細胞呈梭形或長梭形。2～3周后原代細胞融合成片，即可進行傳代培養(yǎng)。傳代細胞呈單層及多層重疊

4、成長，為典型的峰谷狀。以上觀察符合動脈平滑肌細胞形態(tài)學特征；2)、抗α—actin抗體免疫細胞化學染色顯示，95％培養(yǎng)的細胞染色陽性，表明培養(yǎng)的細胞為平滑肌細胞而且純度較高。2、血管成纖維細胞的鑒定：1)在相差倒置顯微鏡下觀察，3天左右有細胞自組織塊周圍游出，細胞呈多角形，1-2周后原代細胞融合成片，即可進行傳代培養(yǎng)，傳代后細胞呈旋渦狀生長，符合成纖維細胞生長特征，。 二、獲得的質(zhì)粒目的片段經(jīng)序列測定與所提供片段相符合，所得到的

5、腺病毒載體對細胞進行干擾后效果明顯，GFP持續(xù)表達大于96小時，Cx43蛋白干擾后在表達呈陰性。 三、Fujii細胞模型中，在OxyHb孵育24、48、72、96小時后，其長度分別為37.57±18.12um、34.604±17.33um、30.18±20.86um、44.35±19.74um與正常對照組64.46±24.36um相比較平滑肌細胞明顯縮短，收縮率分別為41.71％、46.32％、53.18％、31.20％(P＜0

6、.05)，且在24小時組及96小時組細胞長度明顯長于72小時組(P＜0.05)。western blot顯示平滑肌受到OxyHb孵育后，Cx43在24-96小時內(nèi)其值分別為3.487±0.122、4.835±0.083、6.636±0.135、4.803±0.058與正常對照組1.988±0.075相比，平滑肌細胞的Cx43蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，其升高率分別為75.40％、143.20％、233.80％、141.60％，24

7、-72小時為遞增趨勢(P＜0.05)。96小時與72小時組相比明顯下降(P＜0.05)，在免疫組織化學實驗中顯示，Cx43在平滑肌細胞中的陽性指數(shù)在24-96小時分別為1.88±0.21、2.52±0.55、2.87±0.32、2.36±0.38，相對正常對照組的陽性指數(shù)1.35±0.13相比，Cx43增多分別為39.26％、86.67％、112.59％、74.81％，明顯升高(P＜0.05)，且96小時組明顯低于72小時組(P＜0.0

8、5)。在立體共培養(yǎng)模型中，在OxyHb孵育OxyHb孵育血管成纖維細胞后24、48、72小時后，平滑肌長度分別為42.45±25.28um、38.27±22.33um、33.65±21.23um與正常正常對照組65.25±20.33um相比，收縮率分別為34.94％、41.35％、48.43％，痙攣明顯(P＜0.05)，且24-72小時組細胞長度呈遞減趨勢(P＜0.05)，非直接接觸組2.13±27.35um、條件對照組64.38±18

9、.22um，與正常對照組相比無明顯痙攣(P＞0.05)。western blot顯示以OxyHb孵育血管成纖維細胞后，平滑肌細胞的Cx43的相對含量分別為3.558±0.087、4.533±0.042、5.675±0.226與正常對照組正常對照組1.937±0.121相比，Cx43的表達分別增高83.69％、134.21％、193.99％，增高趨勢明顯(P＜0.05)，且在24—72小時內(nèi)呈遞增趨勢。非直接接觸組1.857±0.110、

10、條件對照組1.968±0.076與正常對照組無明顯差異(P＞0.05)。免疫細胞熒光顯示OxyHb孵育血管成纖維細胞后，平滑肌細胞的Cx43陽性指數(shù)OxyHb孵育后24小時組1.89+0.55、OxyHb孵育后48小時組2.33±0.62、OxyHb孵育后72小時組2.60+0.22、非直接接觸組1.28±0.15、條件對照組1.37±0.30，其中24、48、72小時組陽性指數(shù)教正常對照組分別升高37.96％、70.07％、89.78

11、％，增高趨勢明顯(P＜0.05)，且24－72小時呈遞增趨勢(P＜0.05)。非直接接觸組及條件對照組與正常對照組無明顯差異。 四、Fujii細胞模型在對平滑肌進行RNA干擾后的細胞在OxyHb孵育24、48、72、96小時后細胞長度分別為僅干擾組62.78±30.15、干擾后OxyHb孵育24小時組53.77±23.13、干擾后OxyHb孵育48小時組50.35±25.78、干擾后OxyHb孵育72小時組50.07±18.75

12、、干擾后OxyHb孵育96小時組54.27±26.34、相對于未做RNA干擾的相同時間段的平滑肌細胞長度痙攣程度得到顯著抑制；Ad5-EGFP OxyHb孵育72小時組31.28±17.44與OxyHb孵育72小時組30.18±20.86，無顯著差異(P＞0.05)，與正常對照組64.46±24.36收縮明顯(P＜0.05)。通過western blot檢測Cx43蛋白，其相對含量分別為僅干擾組0、干擾后OxyHb孵育24小時組1.62

13、4±0.080、干擾后OxyHb孵育48小時組1.657±0.157、干擾后OxyHb孵育72小時組1.701±0.223、干擾后OxyHb孵育96小時組1.473±0.167、Ad5-EGFP對照OxyHb孵育96小時組4.533±0.132、正常對照組1.988±0.275、OxyHb孵育96小時組4.803±0.058。在接受RNA干擾的各組平滑肌細胞的Cx43的表達與正常對照組無明顯差異，與OxyHb孵育96小時組差異顯著(P＜

14、0.01)。Ad5-EGFP OxyHb孵育96小時組與OxyHb孵育96小時組無明顯差異(P＞0.05)。通過免疫細胞化學對Cx43陽性指數(shù)的檢測，僅干擾組O、干擾后OxyHb孵育24小時組1.03±0.22、干擾后OxyHb孵育48小時組1.12±0.17、干擾后OxyHb孵育72小時組1.33±0.33、干擾后OxyHb孵育96小時組1.25±0.16、Ad5—EGFP對照OxyHb孵育96小時組2.43±0.45、正常對照組1.

15、35±0.13、OxyHb孵育96小時組2.36±0.38。在接受Cx43RNA干擾的各組平滑肌細胞與正常對照組相比僅干擾組0、干擾后OxyHb孵育24小時組干擾后OxyHb孵育48小時組、明顯低于正常對照組(P＜0.05)，干擾后OxyHb孵育72小時組干擾后及OxyHb孵育96小時組與正常對照組無明顯差異(P＞0.05)。Ad5-EGFP OxyHb孵育96小時組與OxyHb孵育96小時組無明顯差異(P＞0.05)，與正常對照組差異

16、顯著(P＜0.05)。在立體共培養(yǎng)模型中，在對血管成纖維細胞進行RNA干擾再給予OxyHb孵育，其平滑肌長度為：僅干擾組62.15±24.87、干擾后OxyHb孵育24小時組58.13±25.22、干擾后Oxynb孵育48小時組53.25±16.87、干擾后OxyHb孵育72小時組52.16±20.15、Ad5-EGFPOxyHb孵育72小時組31.28±18.33、正常對照組65.25±20.33、OxyHb孵育72小時組33.65±

17、21.23，接受Cx43 RNA干擾的各組細胞的長度均較同時間段未給予RNA干擾的細胞長度增長(P＜0.05)。Ad5-EGFP OxyHb孵育72小時組細胞長度與OxyHb孵育72小時組無明顯差異(P＞0.05)，與正常對照組差異明顯(P＜0.05)。 結(jié)論；1、OxyHb對基底動脈平滑肌細胞有收縮作用。2、腦血管痙攣時，基底動脈平滑肌細胞的Cx43蛋白含量明顯升高，并且呈時間依賴性。3.在對其進行RNAi后，其含量明顯下降，