反義Cx43對不穩(wěn)定逼尿肌細胞間縫隙連接通訊的抑制作用研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌不穩(wěn)定(DI)是指儲尿期逼尿肌出現(xiàn)無抑制收縮，常繼發(fā)于膀胱出口梗阻(BOO)，是多種病變(如神經(jīng)疾病、膀胱出口梗阻等)的一個共同的病理生理環(huán)節(jié)，是最常見的一種膀胱功能障礙，是引起尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等臨床癥狀的直接原因，嚴重者還將引起腎、輸尿管積水和腎功能損害，嚴重影響了患者的健康狀況及生活質(zhì)量。有關(guān)DI的發(fā)生機理目前還不清楚。DI的臨床治療雖有多種方法，但療效不佳，亟待解決。 正常情況下逼尿肌的協(xié)調(diào)收縮主

2、要是由神經(jīng)參與支配的，逼尿肌細胞間的興奮傳遞作用并不起主導(dǎo)作用。DI情況下，逼尿肌的收縮是不受意志控制、自發(fā)的，其本身具有一定的自發(fā)興奮性。但是單個細胞的興奮是無法引起全膀胱的協(xié)調(diào)收縮的，單細胞興奮必須經(jīng)過特殊的細胞間興奮傳遞機制才能引起整個膀胱組織協(xié)調(diào)一致的收縮。因此，細胞間的興奮傳遞可能在DI發(fā)生中有極其重要的作用。 細胞間通訊對于多細胞生物體具有重要意義，其所介導(dǎo)的新陳代謝偶聯(lián)和電化學(xué)偶聯(lián)對于多細胞行為的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是不可或缺

3、的?？p隙連接是位于兩個相鄰細胞間的通道結(jié)構(gòu)，是細胞間通訊的一條重要途徑。它允許分子量小于1000道爾頓的小分子物質(zhì)(如離子、第二信使、Ca2+、cAMP、cGMP等)在相鄰細胞間快速傳遞。除了紅細胞和成人骨骼肌細胞外，縫隙連接存在于哺乳動物所有的組織中。 縫隙連接通道的直徑約30埃米，包括由相鄰細胞提供的兩個半通道，每個半通道(連接子)由屬于連接蛋白基因家族的六個蛋白亞基組成。到目前為止，在哺乳動物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的連接蛋白已達20余種

4、，它們擁有相同的結(jié)構(gòu)：四個跨膜區(qū)，胞內(nèi)N末端、C末端以及兩個胞外連接袢。 縫隙連接介導(dǎo)的細胞間通訊稱為縫隙連接細胞間通訊，它參與了生物體內(nèi)的許多生物學(xué)過程，如子宮平滑肌細胞的協(xié)調(diào)收縮、相鄰細胞間營養(yǎng)物質(zhì)和離子的交換、控制細胞的生長發(fā)育等等。在眾多的組織器官中，心肌組織中的縫隙連接通訊研究得最為充分，縫隙連接通訊可以介導(dǎo)對于心肌組織協(xié)調(diào)收縮具有重要意義的快速、有序的動作電位傳播。 和心肌組織類似，膀胱逼尿肌也具有自發(fā)性收縮

5、，逼尿肌不穩(wěn)定的典型特征就是逼尿肌不受意志控制的、自發(fā)的收縮活動。因此，DI的產(chǎn)生可能與縫隙連接通訊有著密切的關(guān)系。但是目前國內(nèi)外關(guān)于膀胱逼尿肌興奮傳遞的研究還鮮有報道。我們的前期研究已經(jīng)在組織水平證明DI情況下逼尿肌組織縫隙連接大量增加，相應(yīng)的細胞水平功能研究亦發(fā)現(xiàn)細胞間通訊功能加強。但是各種具體連接蛋白在逼尿肌細胞間縫隙連接通訊中所起的作用目前還不清楚，作為DI情況下增加較為顯著的連接蛋白，Cx43可能在此過程中起著重要作用，有必要

6、對其進行進一步的研究。同時，對這一問題的研究有助于我們更深入地了解DI發(fā)生的機理，為探求以阻斷逼尿肌細胞間興奮傳遞為手段、探索新型有效的DI治療方法提供理論基礎(chǔ)。 本課題主要從以下幾個方面對逼尿肌細胞進行研究：第一，在前一階段組織水平觀察的基礎(chǔ)上，進一步研究細胞水平Cx43基因表達變化以及逼尿肌細胞間縫隙連接通訊功能的改變，初步揭示Cx43以及GJIC與逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)系。第二，構(gòu)建Cx43基因反義真核表達載體ASCx43/pC

7、I-neo。第三，將Cx43基因反義真核表達載體ASCx43/pCI-neo導(dǎo)入培養(yǎng)的不穩(wěn)定逼尿肌細胞，觀察Cx43基因封閉對逼尿肌細胞間縫隙連接通訊的影響，揭示Cx43在不穩(wěn)定逼尿肌發(fā)生中的作用，為臨床上采用阻斷細胞間興奮傳遞來治療DI開辟新的方法及提供理論依據(jù)。 方法：本研究通過限制性內(nèi)切酶酶切、連接、轉(zhuǎn)化、提取等方法構(gòu)建了Cx43全長反義真核表達載體。通過尿道近端不全結(jié)扎法建立了穩(wěn)定、合理的大鼠BOO后引起DI的模型。根據(jù)

8、尿動力學(xué)檢查結(jié)果采用隨機法將動物分為：逼尿肌穩(wěn)定組即正常對照組(controlgroup)，逼尿肌不穩(wěn)定組(DetrusorInstabilityGroup)。采用膠原酶消化法常規(guī)分離培養(yǎng)逼尿肌細胞，應(yīng)用半定量RT-PCR及Westernblot等方法從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平檢測連接蛋白Cx43基因及其蛋白的表達變化，利用劃痕標記熒光燃料失蹤技術(shù)觀察不穩(wěn)定逼尿肌細胞間GJIC的功能變化，最后反義基因轉(zhuǎn)染封閉Cx43基因的表達，觀察Cx43基因封

9、閉對不穩(wěn)定逼尿肌細胞間縫隙連接通訊的抑制作用，揭示Cx43以及GJIC的功能變化與逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)系。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下： 1.Cx43mRNA在DI組及正常對照組膀胱逼尿肌細胞中均有表達，DI組表達較正常對照組明顯增加，約為對照組的2.97倍，兩者相比較具有非常顯著性差異； 2.Cx43蛋白在DI組及正常對照組膀胱逼尿肌細胞中均有表達，DI組表達較正常對照組明顯增加，約為對照組的3.15倍，兩者相比較具有

10、非常顯著性差異，與Cx43mRNA表達程度相近似。 3.DI組及正常對照組膀胱逼尿肌細胞間均存在縫隙連接通訊，DI組逼尿肌細胞間縫隙連接通訊功能較正常對照組明顯增強，約為對照組的5.61倍，兩者相比較具有非常顯著性差異； 4.成功構(gòu)建了Cx43基因反義真核表達載體； 5.反義轉(zhuǎn)染組Cx43mRNA的表達明顯降低，約為空載轉(zhuǎn)染組的61％，兩者相比較有非常顯著性差異； 6.反義轉(zhuǎn)染組Cx43蛋白的表達明顯降低

11、，約為空載對照組的56％，兩者相比較有非常顯著性差異； 7.反義轉(zhuǎn)染組逼尿肌細胞間縫隙連接通訊功能明顯降低，約為空載對照組的82％，兩者相比較具有顯著性差異。 結(jié)論：主要結(jié)論如下： 1.體外培養(yǎng)不穩(wěn)定逼尿肌細胞中Cx43基因表達較正常對照組增加； 2.體外培養(yǎng)不穩(wěn)定逼尿肌細胞間縫隙連接通訊功能較正常對照組增強； 3.縫隙連接通訊功能的增強可能在DI的發(fā)生過程中起著重要作用； 4.反義Cx4