Cx43高表達(dá)心肌細(xì)胞系的建立及在對(duì)抗冷保存損傷中的應(yīng)用和機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　 心臟移植手術(shù)為嚴(yán)重終末期心臟病患者帶來(lái)了福音,而減輕供心低溫保存過(guò)程中的損傷是心臟移植成功的關(guān)鍵,盡管許多研究者對(duì)各種心臟保存液的成分及其灌注方式進(jìn)行了調(diào)整,如添加血漿有效成分、氟碳化合物、氧自由基清除劑、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、鈣離子拮抗劑等,這些都不同程度地提高了低溫保存心臟的心功能,但供體心臟保存時(shí)間大于6h時(shí),這些改進(jìn)措施的效果不理想。供心在低溫保存期間細(xì)胞凋亡的發(fā)生是制約心臟保存時(shí)限的主要因素之一。若能有效地抑制心肌細(xì)胞

2、凋亡,就有可能為器官低溫保存提供新的藥物作用靶點(diǎn),提高供心在長(zhǎng)時(shí)程低溫保存的有效性,延長(zhǎng)供心保存時(shí)間,使遠(yuǎn)距獲取供心,擴(kuò)大供心來(lái)源成為可能。連接蛋白43(connexin43,Cx43)是心室肌細(xì)胞間的一種主要的連接蛋白。以往的研究一直認(rèn)為,Cx43僅存在于心肌細(xì)胞質(zhì)膜上,在心肌細(xì)胞膜表面,6個(gè)Cx43形成一個(gè)連接子,再由相鄰細(xì)胞接觸面上的連接子對(duì)接而成的縫隙連接通道,該通道主要介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的電耦聯(lián)和小分子化學(xué)信號(hào)分子的傳遞(如K+、

3、Na+、Ca2+、cAMP、IP3等),即心肌細(xì)胞間通訊的作用.然而近年的研究發(fā)現(xiàn)Cx43的分布并不局限于細(xì)胞質(zhì)膜上,且除了細(xì)胞間通訊外還可能存在其他新的功能。
　　 目的
　　 (1)研究Cx43蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)冷保存H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 (2)探討Cx43蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)抗冷保存誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。
　　 方法
　　 (1)pEGFP-c1-Cx43真核表達(dá)載體的構(gòu)建:收集培養(yǎng)

4、的H9c2細(xì)胞提取其總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)大鼠Cx43基因閱讀開放框(open reading frame,ORF)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,并在引物中引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ。上游引物:5'TCCAGTCACCCATAGAATTCGAA3',其中下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn),下游引物:5'GTGGATCCTTAAATCTCCAGGT3',其中下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以此為引物,以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版,PC

5、R擴(kuò)增Cx43全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定的PCR產(chǎn)物膠回收后用EcoRⅠ和BamHⅠ分別酶切2小時(shí),進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物抽干后用T4 DNA Ligase22℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,隨后挑取克隆,酶切鑒定為陽(yáng)性后,送上海生工生物有限公司測(cè)序。
　　 (2)構(gòu)建點(diǎn)突變載體S262A-Cx43:利用定點(diǎn)突變技術(shù),設(shè)計(jì)包含一對(duì)突變位點(diǎn)的引物,上游引物:5'AAAGACTGCGGAGCTC

6、CAAAATACG3';下游引物:5'CGTATTTTGGAGCTCCGCAGTCTTT3'。以構(gòu)建的pEGFP-c1-Cx43為模版,PCR擴(kuò)增質(zhì)粒全長(zhǎng).將PCR產(chǎn)物用DpnⅠ酶切,消化模板質(zhì)粒。將消化后的PCR產(chǎn)物沉淀,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。所得的質(zhì)粒即為Cx43蛋白磷酸化位點(diǎn)第262位絲氨酸(S)突變成丙氨酸(A)的突變體。
　　 (3)Western blotting:利用Cx43、和p-S262-Cx43抗體觀察各組細(xì)

7、胞總Cx43蛋白的表達(dá)和S262磷酸化情況。
　　 (4)實(shí)驗(yàn)分組和冷保存處理:分無(wú)轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)、空載體組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pEGFP-c1-Cx43的H9c2細(xì)胞組(Cx43組)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pEGFP-c1-S262A-Cx43的H9c2細(xì)胞組(S262A-Cx43組)。各組細(xì)胞在Celsior保存液4℃保存0-48 h后,去Celsior保存液換成DMEM培養(yǎng)基,放入37℃、CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h

8、。
　　 (5)細(xì)胞活力測(cè)定:取體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞,用MTT法測(cè)定冷保存后細(xì)胞活力。
　　 (6)LDH測(cè)定:測(cè)定各組細(xì)胞冷保存后培養(yǎng)基中LDH含量。
　　 結(jié)果
　　 (1)酶切和測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pEGFP-c1-Cx43真核表達(dá)載體和其262位絲氨酸突變體S262A。
　　 (2)過(guò)表達(dá)Cx43蛋白對(duì)冷保存誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的影響空白對(duì)照組細(xì)胞低溫保存12-48 h再常溫培養(yǎng)1h

9、后,與低溫保存0 h的細(xì)胞相比,細(xì)胞存活率明顯降低,LDH釋放量增加(P＜0.05)。與經(jīng)過(guò)相同時(shí)間低溫保存處理的空白對(duì)照組細(xì)胞相比,Cx43組細(xì)胞的存活率顯著增高,LDH含量顯著下降。
　　 (3)過(guò)表達(dá)Cx43的H9c2細(xì)胞對(duì)抗冷保存損傷作用與縫隙連接的形成無(wú)關(guān) MTT結(jié)果顯示,不同密度接種的空載體組細(xì)胞冷保存后細(xì)胞活力均呈時(shí)間依賴性降低,而Cx43組細(xì)胞即使在低密度接種(Cx43不形成細(xì)胞間縫隙連接)的情況下,仍可顯著對(duì)抗