β-,3--AR基因Trp64ArgSNP與存在OAB的逼尿肌細胞內(nèi)cAMP濃度的關(guān)系研究.pdf

1、目的： 目前研究膀胱過度活動證(OAB)的發(fā)生機制主要集中在逼尿肌受體的異常，已證實在介導(dǎo)逼尿肌松弛中起主要作用的是β3腎上腺素能受體(β3—AR)。通過進行逼尿肌細胞的培養(yǎng)，對比分析OAB病例和正常對照組之間β3—AR的Trp64ArgSNP的基因突變率，以及存在此突變的β3—AR OAB病例與其他對照組在不同濃度BRL37344激活下逼尿肌細胞內(nèi)cAMP表達水平的比較，明確此β3—AR基因突變是OAB發(fā)生及治療耐藥的一個原因

2、。 方法： 一、逼尿肌細胞的培養(yǎng) 選取臨床尿動力學(xué)檢測證實為OAB病例22名和20名正常作對照，取膀胱組織行逼尿肌細胞培養(yǎng)。 (1)、原代逼尿肌細胞分離 (2)、原代逼尿肌細胞的培養(yǎng) (3)、逼尿肌細胞的傳代 (4)、逼尿肌細胞的鑒定 二、對比分析OAB組與對照組β3—AR的Trp64ArgSNP的突變率 (1)、DNA提取 (2)、DNA測序 三、

3、對比分析β3—AR的Trp64ArgSNP與其引起的cAMP表達水平的關(guān)系 將經(jīng)過鑒定的逼尿肌細胞按OAB組存在β3—AR的Trp64ArgSNP、OAB組野生型β3—AR和對照組野生型β3—AR分別加入100μl BRL—37344(4個濃度組——10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)，用超聲細胞破碎儀破碎細胞(30s×5次)，12000r/mIn4℃離心10 min，然后分別吸取上清液留用。cAMP的測定按cA

4、MP放射免疫試劑盒說明書進行。 結(jié)果： 一、細胞培養(yǎng) (1)、原代培養(yǎng)的逼尿肌細胞生長形態(tài) (2)、逼尿肌細胞的免疫組化鑒定 二、OAB組與對照組β3—AR的Trp64ArgSNP突變率 OAB組22名病例發(fā)生突變12名，突變率55％；對照組20名病例發(fā)生突變4名，突變率20％。兩組突變率有顯著性差異(X2=5.30，P<0.05)。 三、β3—AR的Trp64ArgSNP與其引

5、起的cAMP表達水平的關(guān)系 OAB組Trp64ArgSNP的β3—AR逼尿肌細胞，野生型β3—AR逼尿肌細胞，以及對照組野生型β3—AR逼尿肌細胞的三種細胞產(chǎn)生的cAMP水平在BRL—37344(10-10～10-7mol/L)作用下呈劑量依賴關(guān)系，經(jīng)q檢驗其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，BRL—37344最大作用見于10-7mol/L。 對比分析在BRL—37344各個濃度(10-7、10-8、10-9、10-1

6、0mol/L)下，OAB組Trp64ArgSNP的β3—AR逼尿肌細胞，野生型β3—AR逼尿肌細胞，以及對照組野生型β3—AR逼尿肌細胞的三種細胞產(chǎn)生的cAMP水平，經(jīng)q檢驗其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果表明對照組野生型β3—AR逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最高，OAB組Trp64ArgSNP的β3—AR膀胱逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最低。 結(jié)論 1、OAB組病例β3—AR的Trp64ArgSNP突變率明顯增

7、高，不同BRL—37344濃度下，OAB病例組Trp64ArgSNP的β3—AR和野生型β3—AR逼尿肌細胞表達的cAMP水平均低于對照組野生型β3—AR逼尿肌細胞，OAB病例β3—AR松弛逼尿肌功能障礙與該受體亞型Trp64ArgSNP有關(guān)。 2、OAB病例組Trp64ArgSNP的β3—AR逼尿肌細胞的BRL—37344濃度依賴性cAMP表達水平升高的趨勢明顯低于該組中野生型的β3—AR逼尿肌細胞，β3—AR的Trp64Ar