Cx26-Cx32組成的細(xì)胞縫隙連接對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響.pdf

1、研究背景： 順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床常用的抗腫瘤藥，屬細(xì)胞周期非特異性藥物。它通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)以非電荷形式通過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后氯離子被水分子取代，呈陽性電荷，然后與DNA上的堿基結(jié)合，形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，破壞DNA的功能。如果這種損傷未能修復(fù)，將導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯在G2期并出現(xiàn)凋亡及死亡。 順鉑對(duì)睪丸癌、卵巢癌、肺癌和頭頸部癌等實(shí)體瘤都有很好的療效，是多種腫瘤化療方案中的組成藥物。但是，腫瘤對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性

2、(內(nèi)在性或獲得性)，影響了順鉑的臨床療效；至今為止，順鉑耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理仍未闡明。闡明腫瘤對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，對(duì)于減少耐藥、提高順鉑的療效、擴(kuò)大順鉑臨床應(yīng)用范圍具有重要的指導(dǎo)意義。 細(xì)胞縫隙連接(gapjunction，GJ)是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器(如心臟，肝臟，腎臟，中樞神經(jīng)，皮膚，肌肉等)組織中。GJ提供了一種細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接聯(lián)系通道，是細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的一種重要方式。GJ異常與許多疾病

3、(包括腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。在多數(shù)腫瘤的形成過程中，常伴隨GJ功能降低或消失?；謴?fù)腫瘤細(xì)胞的GJ，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長、分化，有利于重建正常的細(xì)胞生長調(diào)控機(jī)制。因此，GJ是一種公認(rèn)的腫瘤抑制因素。最近的研究證明：在培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，GJ能夠增強(qiáng)多種化學(xué)毒物引起細(xì)胞凋亡的作用。我們和其它研究發(fā)現(xiàn)：順鉑的細(xì)胞毒性在GJ存在的情況下顯著增強(qiáng)。 GJ影響順鉑等抗腫瘤藥物細(xì)胞毒性的機(jī)理不明。順鉑等抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性在有

4、GJ存在的情況下增強(qiáng)這一事實(shí)表明，順鉑等在引起細(xì)胞凋亡(或壞死)的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了某種可以通過GJ傳遞的“死亡信號(hào)”；這種“死亡信號(hào)”通過GJ傳遞到毗鄰的細(xì)胞，引起其它細(xì)胞死亡或加強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，這種現(xiàn)象稱為“旁細(xì)胞效應(yīng)”。我們推測，當(dāng)GJ功能降低時(shí)，順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的“死亡信號(hào)”不能通過GJ擴(kuò)散到毗鄰的細(xì)胞；這種“旁細(xì)胞效應(yīng)”減弱或消失將會(huì)導(dǎo)致順鉑的細(xì)胞毒性降低。根據(jù)此推測和腫瘤組織常伴有GJ功能降低或消失的事實(shí)，我們假設(shè)：腫瘤細(xì)胞

5、GJ功能減退導(dǎo)致順鉑細(xì)胞毒性降低，這可能是順鉑耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理之一。 為了證明這一假設(shè)，本研究擬在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLa細(xì)胞上，用多種方法改變GJ功能，通過觀察GJ功能改變對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響，深入探討GJ與順鉑細(xì)胞毒性的關(guān)系。 研究方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLA細(xì)胞，用“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”(standardcolony-formingassay)和SRB(sulf

6、orhodamineB)法測定順鉑對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用(細(xì)胞毒性)。 用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長融合細(xì)胞(有條件形成GJ)與生長未融合細(xì)胞(無形成GJ的條件)。在上述不同密度接種的細(xì)胞，觀察GJ形成對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性影響。 用“細(xì)胞接種熒光示蹤法”(ParachuteAssay)測定培養(yǎng)細(xì)胞間的GJ功能；并觀察目前常用的能影響GJ藥物oleamide，18-α-GA和RA對(duì)由Cx26/Cx32組成的GJ功能的影響。

7、 用doxycycline控制Cormexin表達(dá)，以及用上述藥物改變GJ功能對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、不同細(xì)胞生長密度對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在生長融合和生長未融合的細(xì)胞，5μM順鉑作用1小時(shí)后，都能夠顯著地降低細(xì)胞集落形成率。在生長融合細(xì)胞(細(xì)胞之間形成緊密接觸，有條件形成GJ)，順鉑對(duì)細(xì)胞集落生長的抑制率明顯高于生長未融合細(xì)胞(細(xì)胞之間未形成接觸，無形成GJ的條

8、件)。SRB結(jié)果顯示，在1×103～4×104/ml的范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞密度的增加，5μM順鉑作用24小時(shí)后順鉑細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明，細(xì)胞密度增加可顯著增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。 2、改變Connexin表達(dá)對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，在一定范圍內(nèi)(0.01-1μg/ml)，隨著doxycycline濃度的增加，細(xì)胞通過GJ的熒光傳遞功能逐漸增強(qiáng)。結(jié)果證明，增加doxycycline的濃度，不僅可以增加

9、Cx的表達(dá)，而且能夠增加GJ形成和功能。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)(0.01—1μg/ml)，隨著doxycycline濃度的升高，順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制率逐漸增加。結(jié)果證明，順鉑的細(xì)胞毒性隨GJ功能的增強(qiáng)而增大。 3、抑制GJ功能對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 Oleamide和α-GA是常用的GJ抑制劑，但未見有對(duì)由Cx26/Cx32組成的GJ功能影響的報(bào)道。細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，25μMoleam

10、ide組和10μMα-GA組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低，證明oleamide和18-α-GA能降低由Cx26/Cx32組成的GJ功能。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在高密度接種細(xì)胞(生長融合，有GJ形成)，用25αMoleamide和10μM18-α-GA抑制GJ功能，5μM順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制率明顯降低，而在低密度接種細(xì)胞(生長未融合，無GJ形成)，oleamide，α-GA對(duì)順鉑的集落形成抑制率無明顯影響。結(jié)果表明降低GJ功能可降低

11、順鉑的細(xì)胞毒性。 4、增強(qiáng)GJ功能對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 RA是公認(rèn)GJ增強(qiáng)劑，但未見有對(duì)由Cx26/Cx32組成的GJ功能影響的報(bào)道。細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，10μMRA組的細(xì)胞熒光傳遞功能增強(qiáng)。結(jié)果證明，RA顯著增強(qiáng)由Cx26/Cx32組成的GJ功能。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在高密度接種細(xì)胞(生長融合，有GJ形成)，使用10μMRA增強(qiáng)GJ功能，5αM順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制率明顯增高。而在低密度接種細(xì)胞