縫隙連接蛋白Cx32對(duì)依托泊苷體外抗腫瘤作用的影響及鞣花酸的增效作用.pdf

1、目的：
　　1．觀(guān)察由Cx32組成的縫隙連接(gap junction, GJ)對(duì)依托鉑苷抗腫瘤作用的影響；
　　2．觀(guān)察鞣花酸(ellagic acid, EA)對(duì)依托泊苷(etoposide, VP-16)體外抗腫瘤作用的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　在轉(zhuǎn)染Cx32并通過(guò)1μg/ml doxycycline誘導(dǎo)其穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞中，用以下方法進(jìn)行研究：
　　1．細(xì)胞接種免疫熒光法觀(guān)察GJ功能

2、增強(qiáng)劑(retinoid, RA)、GJ功能抑制劑(18-α-GA和oleamide)及EA對(duì)由 Cx32組成縫隙連接細(xì)胞間通訊（gap junction intercellular communication, GJIC）的功能的影響。
　　2．“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”測(cè)定VP-16對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用（抗腫瘤作用）。用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長(zhǎng)融合細(xì)胞（有條件形成GJ）與生長(zhǎng)未融合細(xì)胞（無(wú)形成GJ的條件）。在上述有GJ

3、形成和無(wú)GJ形成的細(xì)胞，觀(guān)察GJ功能和EA通過(guò)GJ功能對(duì)VP-16抗腫瘤作用的影響。
　　3．Hoechst33258熒光染色法和Annexin V/PI結(jié)合雙染流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定HeLa細(xì)胞凋亡率。
　　4．Western blotting法和免疫熒光法分別檢測(cè)Cx32總蛋白和構(gòu)成GJ功能的胞膜蛋白Cx32的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.由 Cx32組成的縫隙連接(gap junction, GJ)對(duì)依托鉑苷抗腫

4、瘤作用的影響
　　1.1“細(xì)胞接種熒光示蹤法”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，25μM oleamide組和10μM18-α-GA組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低，而10μM RA組的細(xì)胞熒光傳遞功能增強(qiáng)?！皹?biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在生長(zhǎng)融合細(xì)胞（GJ形成），VP-16對(duì)集落形成的抑制率為（0.42±0.02），顯著高于生長(zhǎng)未融合細(xì)胞（無(wú)GJ形成，0.25±0.03）；在高密度接種細(xì)胞（生長(zhǎng)融合，有GJ形成）中，與對(duì)照組相比

5、，25μM oleamide和10μM18-α-GA可抑制GJ功能，且能顯著增高VP-16處理后的細(xì)胞集落形成率(P<0.01)；而10μM RA組可通過(guò)增強(qiáng)GJ功能，顯著降低VP-16處理后的細(xì)胞集落形成率（P<0.01）；但在低密度接種細(xì)胞（生長(zhǎng)未融合，無(wú)GJ形成），與對(duì)照組相比，oleamide,18-α-GA及RA對(duì)VP-16的集落形成抑制作用無(wú)明顯影響（P>0.05）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強(qiáng)VP-16的抗腫瘤作用。

6、　　1.2“Hoechst33258熒光染色法”實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，30μM VP-16作用HeLa細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加；在生長(zhǎng)融合細(xì)胞（GJ形成），VP-16誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為（12.13±1.34）％，顯著高于生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞（無(wú)GJ形成,6.03%±0.75%）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強(qiáng)VP-16誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用。
　　2.鞣花酸(ellagic acid, EA)對(duì)依托泊苷(etoposide, VP

7、-16)體外抗腫瘤作用的影響
　　2.1在生長(zhǎng)融合細(xì)胞（GJ形成），VP-16（5μM）作用細(xì)胞1h后，聯(lián)用EA（8μM）作用細(xì)胞24h，細(xì)胞集落形成率為（0.25±0.03），顯著低于VP-16單用組（0.42±0.02）；而在生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞（無(wú)GJ形成），EA（8μM）對(duì)VP-16的集落形成抑制作用無(wú)明顯影響（P>0.05）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強(qiáng)EA對(duì)VP-16的抗腫瘤作用。
　　2.2“Annexin V/PI

8、結(jié)合雙染流式細(xì)胞術(shù)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在有GJ形成的HeLa細(xì)胞，EA（8μM）和VP-16（30μM）聯(lián)用作用于細(xì)胞24小時(shí)，早期凋亡率為（12.61±0.30）%，顯著高于VP-16單用組（8.04±0.04）%。“Hoechst33258熒光染色法”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在有GJ形成的細(xì)胞，EA（8μM）和VP-16（30μM）聯(lián)用作用于細(xì)胞24小時(shí)，其細(xì)胞晚期凋亡率為（17.04±0.56）%，顯著高于VP-16單用組（12.13±0.30

9、）%。結(jié)果證明：GJ功能可以增強(qiáng)EA對(duì)VP-16誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用。
　　2.3 EA（8μM）處理細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，”Western blotting”結(jié)果表明，Cx32總蛋白的表達(dá)增強(qiáng)；“免疫熒光法”結(jié)果顯示，構(gòu)成GJ功能的胞膜蛋白Cx32的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
　　2.4“細(xì)胞接種免疫熒光法”結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EA（8μM）作用于生長(zhǎng)融合細(xì)胞（有GJ形成）4小時(shí)，熒光傳遞功能無(wú)明顯影響，而作用24

10、小時(shí)和36小時(shí)，熒光傳遞功能顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1．GJ功能增強(qiáng)，可以增強(qiáng)依托泊苷的抗腫瘤作用，而GJ功能降低可以降低依托泊苷的抗腫瘤作用；
　　2．在生長(zhǎng)融合的細(xì)胞（有GJ形成），鞣花酸可以增強(qiáng)依托泊苷體外抗腫瘤作用；
　　3．鞣花酸增強(qiáng)依托泊苷的體外抗腫瘤作用與增強(qiáng)Cx32總蛋白和形成GJ功能的胞膜蛋白Cx32表達(dá)有關(guān)；
　　4．鞣花酸增強(qiáng)依托泊苷的體外抗腫瘤作用與增強(qiáng)由Cx32組成的GJIC功