縫隙連接蛋白Cx32對依托泊苷體外抗腫瘤作用的影響及鞣花酸的增效作用.pdf

1、目的：
　　1．觀察由Cx32組成的縫隙連接(gap junction, GJ)對依托鉑苷抗腫瘤作用的影響；
　　2．觀察鞣花酸(ellagic acid, EA)對依托泊苷(etoposide, VP-16)體外抗腫瘤作用的影響及其可能機制。
　　方法：
　　在轉(zhuǎn)染Cx32并通過1μg/ml doxycycline誘導(dǎo)其穩(wěn)定表達的HeLa細胞中，用以下方法進行研究：
　　1．細胞接種免疫熒光法觀察GJ功能

2、增強劑(retinoid, RA)、GJ功能抑制劑(18-α-GA和oleamide)及EA對由 Cx32組成縫隙連接細胞間通訊（gap junction intercellular communication, GJIC）的功能的影響。
　　2．“標準細胞集落形成分析法”測定VP-16對細胞生長的抑制作用（抗腫瘤作用）。用不同密度接種細胞的方法，獲得生長融合細胞（有條件形成GJ）與生長未融合細胞（無形成GJ的條件）。在上述有GJ

3、形成和無GJ形成的細胞，觀察GJ功能和EA通過GJ功能對VP-16抗腫瘤作用的影響。
　　3．Hoechst33258熒光染色法和Annexin V/PI結(jié)合雙染流式細胞術(shù)分別測定HeLa細胞凋亡率。
　　4．Western blotting法和免疫熒光法分別檢測Cx32總蛋白和構(gòu)成GJ功能的胞膜蛋白Cx32的表達。
　　結(jié)果：
　　1.由 Cx32組成的縫隙連接(gap junction, GJ)對依托鉑苷抗腫

4、瘤作用的影響
　　1.1“細胞接種熒光示蹤法”實驗結(jié)果表明：與對照組相比，25μM oleamide組和10μM18-α-GA組的細胞熒光傳遞功能顯著降低，而10μM RA組的細胞熒光傳遞功能增強。“標準細胞集落形成分析法”實驗結(jié)果顯示：在生長融合細胞（GJ形成），VP-16對集落形成的抑制率為（0.42±0.02），顯著高于生長未融合細胞（無GJ形成，0.25±0.03）；在高密度接種細胞（生長融合，有GJ形成）中，與對照組相比

5、，25μM oleamide和10μM18-α-GA可抑制GJ功能，且能顯著增高VP-16處理后的細胞集落形成率(P<0.01)；而10μM RA組可通過增強GJ功能，顯著降低VP-16處理后的細胞集落形成率（P<0.01）；但在低密度接種細胞（生長未融合，無GJ形成），與對照組相比，oleamide,18-α-GA及RA對VP-16的集落形成抑制作用無明顯影響（P>0.05）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強VP-16的抗腫瘤作用。

6、　　1.2“Hoechst33258熒光染色法”實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，30μM VP-16作用HeLa細胞24小時，細胞凋亡率明顯增加；在生長融合細胞（GJ形成），VP-16誘導(dǎo)細胞凋亡率為（12.13±1.34）％，顯著高于生長未融合的細胞（無GJ形成,6.03%±0.75%）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強VP-16誘導(dǎo)細胞的凋亡作用。
　　2.鞣花酸(ellagic acid, EA)對依托泊苷(etoposide, VP

7、-16)體外抗腫瘤作用的影響
　　2.1在生長融合細胞（GJ形成），VP-16（5μM）作用細胞1h后，聯(lián)用EA（8μM）作用細胞24h，細胞集落形成率為（0.25±0.03），顯著低于VP-16單用組（0.42±0.02）；而在生長未融合的細胞（無GJ形成），EA（8μM）對VP-16的集落形成抑制作用無明顯影響（P>0.05）。結(jié)果證明：GJ功能可以增強EA對VP-16的抗腫瘤作用。
　　2.2“Annexin V/PI

8、結(jié)合雙染流式細胞術(shù)”實驗結(jié)果顯示：在有GJ形成的HeLa細胞，EA（8μM）和VP-16（30μM）聯(lián)用作用于細胞24小時，早期凋亡率為（12.61±0.30）%，顯著高于VP-16單用組（8.04±0.04）%?！癏oechst33258熒光染色法”實驗結(jié)果表明：在有GJ形成的細胞，EA（8μM）和VP-16（30μM）聯(lián)用作用于細胞24小時，其細胞晚期凋亡率為（17.04±0.56）%，顯著高于VP-16單用組（12.13±0.30

9、）%。結(jié)果證明：GJ功能可以增強EA對VP-16誘導(dǎo)細胞的凋亡作用。
　　2.3 EA（8μM）處理細胞24小時和48小時后，與對照組相比，”Western blotting”結(jié)果表明，Cx32總蛋白的表達增強；“免疫熒光法”結(jié)果顯示，構(gòu)成GJ功能的胞膜蛋白Cx32的熒光強度增強。
　　2.4“細胞接種免疫熒光法”結(jié)果顯示：與對照組相比，EA（8μM）作用于生長融合細胞（有GJ形成）4小時，熒光傳遞功能無明顯影響，而作用24

10、小時和36小時，熒光傳遞功能顯著增強。
　　結(jié)論：
　　1．GJ功能增強，可以增強依托泊苷的抗腫瘤作用，而GJ功能降低可以降低依托泊苷的抗腫瘤作用；
　　2．在生長融合的細胞（有GJ形成），鞣花酸可以增強依托泊苷體外抗腫瘤作用；
　　3．鞣花酸增強依托泊苷的體外抗腫瘤作用與增強Cx32總蛋白和形成GJ功能的胞膜蛋白Cx32表達有關(guān)；
　　4．鞣花酸增強依托泊苷的體外抗腫瘤作用與增強由Cx32組成的GJIC功