縫隙連接蛋白32、36和43介導的癇性發(fā)作機制研究.pdf

1、4-氨基吡啶體內(nèi)致癇動物模型海馬區(qū)Cx32、Cx36和Cx43表達變化
　　目的:觀察4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)誘發(fā)大鼠癇性發(fā)作后海馬區(qū)縫隙連接蛋白32(Connexin32，Cx32)、縫隙連接蛋白36(Connexin36，Cx36)、縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)的mRNA和蛋白表達變化，探討縫隙連接與癇性發(fā)作的關系。
　　方法:55只成年雄性S-D大鼠（體重200-2

2、30g），隨機分為對照組和實驗組。對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水，實驗組采用腹腔注射小劑量4-AP誘發(fā)癇性發(fā)作。實驗組又分為電極組，2h，8h，24h，48h五個亞組。觀察各實驗組大鼠致癇后的行為學變化并記錄全面性強直-陣攣發(fā)作(generalized tonic-clonic seizure，GTCS)的潛伏期;采用腦電圖記錄電極組大鼠致癇后的腦電信號變化;應用免疫組織化學染色方法和Western blot方法測定各組大鼠海馬區(qū)Cx3

3、2、Cx36和Cx43蛋白的表達變化;采用RT-PCR方法測定各組大鼠海馬區(qū)Cx32、Cx36和Cx43mRNA的表達變化。
　　結果:1.行為學和腦電圖結果:實驗組造模成功率為88.9％，大鼠出現(xiàn)GTCS的平均潛伏期為32.2±4.8min。腦電圖顯示致癇后大鼠出現(xiàn)多種形式的癇性放電，包括尖波、棘波和尖慢波。2.免疫組織化學染色結果顯示Cx32、Cx36和Cx43廣泛分布在大鼠腦組織中。實驗組大鼠海馬CA3區(qū)Cx32、Cx36和

4、Cx43免疫陽性細胞數(shù)在致癇后2h較對照組升高(P＜0.05)。其中Cx32免疫陽性細胞數(shù)在致癇后8h達到峰值(P＜0.05)，后逐漸下降，直到致癇后48h仍高于對照組(P＜0.05);Cx36和Cx43免疫陽性細胞數(shù)在致癇后24h達到峰值(P＜0.05)。3.Western blot結果顯示實驗組大鼠海馬區(qū)Cx32、Cx36和Cx43蛋白表達在致癇后2h較對照組升高(P＜0.05)。其中Cx32蛋白在致癇后8h的表達達到峰值(P＜0.

5、05)，后逐漸下降，直到致癇后48h仍高于對照組(P＜0.05);Cx36和Cx43蛋白表達在致癇后24h達到峰值(P＜0.05)。4.RT-PCR結果顯示實驗組大鼠海馬區(qū)Cx32、Cx36和Cx43的mRNA表達在致癇后2h較對照組升高(P＜0.05)。其中Cx32mRNA在致癇后8h的表達達到峰值(P＜0.05)，后逐漸下降，直到致癇后48h仍高于對照組(P＜0.05);Cx36和Cx43 mRNA的表達在致癇后8h達到峰值并一直持

6、續(xù)保持高表達狀態(tài)(P＜0.05)。
　　結論:4-AP誘發(fā)大鼠癇性發(fā)作后，海馬區(qū)Cx32、Cx36、Cx43的基因和蛋白表達上調(diào)，這三者可能參與了癇性發(fā)作過程。
　　縫隙連接阻滯劑在體外腦片上的抗癇作用機制
　　研究目的:探討縫隙連接阻滯劑生胃酮(carbenoxolone，CBX)和Cx36阻滯劑奎寧對海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元癲癇樣放電的影響及可能機制。
　　方法:脫頸椎法分離雄性S-D大鼠（體重50-100g）

7、腦組織，制備300μ m厚度的海馬腦片。采用全細胞盲法膜片鉗電流鉗模式記錄CBX和奎寧對荷包牡丹堿(bicuculline，BMI)及高K+誘發(fā)的海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元動作電位的影響。應用高頻電刺激海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元誘發(fā)長時程增強效應(long-term potentiation，LTP)模擬癇性放電過程，采用電壓鉗模式記錄奎寧對谷氨酸介導的長時程增強效應(LTPGlu)的影響。
　　結果:1.CBX抑制BMI和高K+誘發(fā)的海

8、馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元癲癇樣放電:CBX干預后BMI誘發(fā)的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)明顯下降（從12.5±3.3到5.7±1.4/min，n=8）(P＜0.05)，洗脫CBX后神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)（8.3±2.7/min）部分恢復;CBX干預后高K+誘發(fā)的神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)明顯下降（從18.3±3.6到7.9±2.7/min，n=8）(P＜0.05)，而洗脫CBX后神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)（15

9、.8±3.3/min）基本恢復。2.奎寧抑制BMI和高K+誘發(fā)的海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元癲癇樣放電:奎寧干預后BMI誘發(fā)的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)明顯下降（從7.2±1.6到2.35±1.2/min，n=8）(P＜0.05)，洗脫奎寧后神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)(5.5±1.8/min)部分恢復;奎寧干預后高K+誘發(fā)的神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)明顯下降（從27.4±4.1到13.8±2.6/min，n=8）(P＜

10、0.05)，而洗脫奎寧后神經(jīng)元每分鐘發(fā)作間期樣放電次數(shù)（25.8±3.7/min）基本恢復。3.正常海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元在反復高頻電刺激后能夠誘發(fā)LTPGlu，而奎寧干預后海馬CA3區(qū)神經(jīng)元LTPGlu在反復高頻電刺激后不能被誘發(fā)。
　　結論:1.CBX和奎寧抑制BMI和高K+誘發(fā)的海馬腦片CA3區(qū)神經(jīng)元的癲癇樣放電活動，并且CBX和奎寧對BMI誘發(fā)的癇性電活動的抑制作用更持久。2.奎寧可能通過阻斷Cx36介導谷氨酸遞質(zhì)釋放減少