甲狀腺激素對仔鼠大腦皮層縫隙連接蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、先天性甲狀腺功能減低癥（先天性甲低）是兒科常見的內(nèi)分泌代謝性疾病之一，是由于各種原因?qū)е孪忍煨约谞钕俜置诘募谞钕偌に兀═H）不足引起，是造成兒童智力障礙的原因之一，一直是兒童內(nèi)分泌醫(yī)務(wù)人員關(guān)注的重點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，我們對TH的生理作用有了更深入的了解，TH在細(xì)胞核內(nèi)與其受體（TR）結(jié)合，作用于靶基因啟動子的甲狀腺激素反應(yīng)元件（TREs），在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，然而甲低具體通過影響哪些基因，從而導(dǎo)致兒童智力障礙的機(jī)制目前尚不

2、十分清楚。信號蛋白和相關(guān)的功能蛋白是細(xì)胞各種信息傳導(dǎo)及各種功能代謝活動的執(zhí)行者，為神經(jīng)細(xì)胞生長、分化等活動的基礎(chǔ)，也是神經(jīng)感覺、運(yùn)動、學(xué)習(xí)和記憶等功能活動形成機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，深入研究TH對腦組織信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因?qū)W調(diào)節(jié)，能更全面地揭示甲狀腺調(diào)控腦發(fā)育機(jī)制和先天性甲低的發(fā)病機(jī)制。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)典的細(xì)胞信號連接主要指突觸部位的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，以往研究表明TH參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成、降解，以及遞質(zhì)受體表達(dá)和功能。事實(shí)上，神經(jīng)系統(tǒng)

3、還存在一些非經(jīng)典的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，如縫隙連接（GJ），它們也介導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)的一些重要功能。GJ是構(gòu)成相鄰細(xì)胞間的細(xì)胞縫隙連接通訊（GJC）——一種電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GJ關(guān)鍵成分是縫隙連接蛋白（Cx），其結(jié)構(gòu)單位是由6個(gè)Cx亞單位構(gòu)成連接子，相鄰的細(xì)胞膜對應(yīng)面上的一對連接子構(gòu)成GJ通道-直徑約1.5nm的親水性通道。神經(jīng)系統(tǒng)有豐富的GJ，至少有12種Cx在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，以Cx43最多，占90-95％，然而不同神經(jīng)細(xì)胞上Cx分布存在差異，其

4、中星形膠質(zhì)細(xì)胞上主要是Cx43，少突膠質(zhì)細(xì)胞上主要表達(dá)Cx32，神經(jīng)元上主要表達(dá)Cx36，最近發(fā)現(xiàn)Cx45也有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，數(shù)量也比較豐富。
　　 研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過GJ相互連接形成功能合胞體，GJ還可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成復(fù)雜的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的信息網(wǎng)絡(luò)，GJ連通相互耦聯(lián)細(xì)胞的胞漿，允許一些小分子物質(zhì)在細(xì)胞間通過，為細(xì)胞間物質(zhì)傳遞和信息交流提供了直接通路，還有部分連接子并沒有與相鄰細(xì)胞形成GJ，直接與細(xì)胞外

5、接觸，是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換和信息交流的一種直接通道。GJ在維持內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定、協(xié)調(diào)神經(jīng)元功能方面起著非常重要的作用，在神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)中也起重要作用，而且是腦內(nèi)長短信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，已經(jīng)證實(shí)許多疾病與GJ功能異常有關(guān)。研究表明GJ的通透功能可塑性比較大，先前研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素可能影響心肌細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞Cx43的表達(dá)，但結(jié)果也尚有爭議。然而，至今尚無有關(guān)TH對中樞神經(jīng)系統(tǒng)Cx表達(dá)影響的報(bào)道。
　　 為此，我們

6、首先通過建立先天性甲狀腺功能減低癥的動物模型，檢測先天性甲低對大腦皮層Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的影響。再應(yīng)用離體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察不同甲狀腺素濃度對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的影響，以進(jìn)一步了解TH對星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，為深入研究先天性甲低發(fā)病機(jī)制和保護(hù)干預(yù)措施等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 通過檢測先天性甲低仔鼠大腦皮層Cx43、Cx32和

7、Cx45表達(dá)，以及不同甲狀腺素濃度培養(yǎng)對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)變化，探討先天性甲低對這些縫隙連接蛋白表達(dá)的影響。
　　 動物模型部分
　　 1材料與方法：
　　 1.1動物模型建立和分組
　　 清潔級健康成年C57BL/6J合籠交配后自行產(chǎn)子，按處理?xiàng)l件不同分甲低組和對照組。
　　 甲低組：合籠第10天開始給予母鼠含0.03％甲巰咪唑的飲用水，一直到仔鼠出生7天。

8、r>　　 對照組：一直喂養(yǎng)清潔飲用水，其它實(shí)驗(yàn)控制因素同甲低組。
　　 在仔鼠出生1、7、14和21天麻醉后處死，生理鹽水灌注，留取大腦皮層標(biāo)本。
　　 1.2指標(biāo)檢測
　　 采用Real time RT-PCR法檢測Cx43、Cx32和Cx45的mRNA水平。采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取腦組織總RNA，自行設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用Takara熒光PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增（兩步法）。目的基因mRN

9、A水平采用ΔCt表示。
　　 采用Western blot法檢測Cx43、Cx32和Cx45的蛋白質(zhì)水平。應(yīng)用RIPA裂解液提取腦組織蛋白質(zhì)，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，在丙烯酰胺電泳和轉(zhuǎn)膜后，依次封閉、一抗和二抗孵育、放射自顯影，保存膠片，最后統(tǒng)一將放射自顯影條帶進(jìn)行掃描，對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，將Cx/β-actin的比值作為Cx的相對表達(dá)量。
　　 新鮮腦組織予10％中性福爾馬林固定和石蠟包埋，采用“Envis

10、ion TM二步法”進(jìn)行免疫組化檢測。
　　 2結(jié)果：
　　 對照組出生后Cx43表達(dá)上升，7天時(shí)達(dá)到高峰，此后基本維持穩(wěn)定水平；而甲低組出生后Cx43表達(dá)上升較慢。與對照組比較，1、7和14天甲低組Cx43mRNA有所下降，但差異均不具有顯著性意義。1和7天甲低組Cx43蛋白質(zhì)有下降，其中1天時(shí)差異在邊界水平，7天時(shí)差異具有顯著性意義。免疫組化顯示大腦皮層Cx43表達(dá)均非常豐富，廣泛分布在神經(jīng)細(xì)胞的胞體和神經(jīng)纖維部位。

11、
　　 對照組大腦皮層Cx32表達(dá)水平相對較低，在出生后進(jìn)一步呈逐漸下降趨勢。甲低組在7、14和21天時(shí)Cx32 mRNA均有明顯升高。不同日齡甲低組Cx32蛋白質(zhì)均有上升，其中7日齡時(shí)差異具有顯著性意義，14日齡時(shí)差異在邊界水平。免疫組化顯示大腦皮層的Cx32表達(dá)明顯較Cx43低，部分神經(jīng)元胞體和少量神經(jīng)纖維陽性。
　　 對照組大腦皮層Cx45水平處于Cx45和Cx32間，出生后也逐漸下降。兩組間不同時(shí)間點(diǎn)Cx45mR

12、NA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異均無顯著意義。免疫組化顯示大腦皮層Cx45表達(dá)比較豐富，也較廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞胞體和纖維部位。
　　 細(xì)胞培養(yǎng)部分
　　 1材料和方法：
　　 1.1培養(yǎng)基配制
　　 購買活性炭吸附后低甲狀腺激素胎牛血清（FBS）和未特殊處理的胎牛血清，同時(shí)購買T3配制T3終濃度為5nmol/L的DMEM液。按下列方法配制各種培養(yǎng)液，并測定各組培養(yǎng)液總T3（TT3）和游離T3（FT3）甲狀腺激素濃度。

13、
　　 培養(yǎng)基Ⅰ：普通DMEM+15％普通FBS（TT3:5.4nmol/L，F(xiàn)T3:22.0pmol/L）；
　　 培養(yǎng)基Ⅱ:普通DMEM+15％低TH的FBS（TT3:0.6nmol/L，F(xiàn)T3:1.9 pmol/L）；
　　 培養(yǎng)基Ⅲ:含5nmol/L T3的DMEM+15％低TH的FBS（TT34.3nmol/L，F(xiàn)T323.2 pmol/L）；
　　 1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組
　　 無菌條件

14、下，取生后l～2d健康SD大鼠大腦皮層，置Hanks液中清洗、剪碎、胰蛋白酶消化后，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于培養(yǎng)8天后用抗神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）抗體對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。按照培養(yǎng)基不同，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組：
　　 對照組：培養(yǎng)基Ⅰχ2天+培養(yǎng)基Ⅲχ6天
　　 甲低組：培養(yǎng)基Ⅰχ2天+培養(yǎng)基Ⅱχ6天
　　 干預(yù)組1：培養(yǎng)基Ⅰχ2天+培養(yǎng)基Ⅱχ2天+培養(yǎng)基Ⅲχ4天
　　 干預(yù)組2：培養(yǎng)基Ⅰχ2天+培養(yǎng)基

15、Ⅱχ4天+培養(yǎng)基Ⅲχ2天
　　 1.3檢測指標(biāo)和方法
　　 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）方法繪制生長曲線。采用Takara Real time RT-PCR試劑盒對培養(yǎng)細(xì)胞的Cx43、Cx32和Cx45 mRNA進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用Western blot方法對Cx43、Cx32和Cx45的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色激光共聚焦掃描對蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定位觀察。
　　 2結(jié)果：
　　 甲低組細(xì)胞增殖

16、緩慢，指數(shù)增長期后移，干預(yù)后細(xì)胞增殖有所改善。兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)均豐富。甲低組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)下降，正常甲狀腺激素濃度干預(yù)后又有上升趨勢，早期干預(yù)4天其mRNA水平即能恢復(fù)到正常水平，但蛋白質(zhì)表達(dá)水平尚不能恢復(fù)到正常水平。激光共聚焦掃描顯示離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白質(zhì)表達(dá)均非常豐富，分布于胞體和樹突的胞漿內(nèi)，正常組多數(shù)細(xì)胞間有熒光強(qiáng)度特別高的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，甲低組熒光強(qiáng)度較低，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)少而且熒光強(qiáng)度較低，干預(yù)組1和干預(yù)

17、組2熒光強(qiáng)度和高熒光強(qiáng)度的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)有恢復(fù)趨勢，但干預(yù)組2高熒光強(qiáng)度的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)不均勻。
　　 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx32mRNA水平均較低。與對照組比較，甲低組Cx32mRNA更低，在干預(yù)后mRNA表達(dá)水平能較快上升，達(dá)到正常水平。然而，無論Western blot檢測，還是激光共聚焦掃描，均顯示各組離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx32蛋白質(zhì)表達(dá)均陰性。
　　 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx45表達(dá)均較豐富。甲低組Cx45表達(dá)水平明顯下降，

18、干預(yù)后有所上升，早期干預(yù)后2-4天可恢復(fù)到正常水平。激光共聚焦掃描顯示各組離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx45蛋白表達(dá)均非常非富，分布于胞體和樹突的胞漿內(nèi)，少部分細(xì)胞間有熒光強(qiáng)度特別高的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 1.先天性甲低可導(dǎo)致仔鼠大腦皮層總Cx43表達(dá)下降和總Cx32表達(dá)上升；
　　 2.TH下降可導(dǎo)致離體培養(yǎng)的大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43和Cx45表達(dá)下降，GJ分布異常；
　　 3.TH對神經(jīng)細(xì)胞