乙醇對新生鼠大腦皮層神經(jīng)細胞分化的影響.pdf

1、目的:乙醇（酒精）是目前世界上最濫用的物質(zhì)之一，導(dǎo)致的社會問題也日俱嚴重[1]。目前的研究已經(jīng)表明乙醇能導(dǎo)致大腦皮層、海馬及小腦神經(jīng)細胞變性、萎縮、凋亡及抑制神經(jīng)細胞的分化[2，3]。孕婦酗酒導(dǎo)致的胎兒酒精綜合征是乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害中的嚴重后果，其損害包括誘導(dǎo)神經(jīng)退行性變，促進神經(jīng)細胞凋亡及變性壞死，對神經(jīng)細胞的分化、遷移造成影響等病理性改變。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，幾乎每個神經(jīng)細胞都要經(jīng)歷分化遷移的過程，到達它們

2、發(fā)揮功能的部位，神經(jīng)細胞在分化遷移過程中出現(xiàn)異常，就可能導(dǎo)致很多原發(fā)性神經(jīng)疾病的發(fā)生。迄今為止的研究雖然表明乙醇可能對神經(jīng)細胞的分化遷移造成影響，但造成影響的機制及參與影響分化遷移的基因蛋白，目前國內(nèi)外無詳細報道，本研究設(shè)計采用體外細胞實驗及整體實驗，系統(tǒng)觀察在乙醇的毒性作用下，與神經(jīng)細胞分化遷移密切相關(guān)的神經(jīng)細胞微管相關(guān)蛋白2(microtubeasso ciated protein-2，MAP2)、拓撲異構(gòu)酶Ⅱβ(DNA topoi

3、somereⅡβ，TopⅡ2)、孤兒核受1(nuclearreceptor-related factor1 NURR1)的表達變化，旨在探明MAP2、TopⅡβ、NURR1是否參與了乙醇導(dǎo)致的神經(jīng)細胞分化異常，為神經(jīng)細胞分化異常導(dǎo)致的病理狀態(tài)的防治，提供科學依據(jù)。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)新生鼠大腦皮層細胞:取新生鼠（出生24h內(nèi)），75％酒精消毒，斷頭取腦，剖開頭骨暴露大腦半球，放于D-Hanks液中（所有操作于冰上）

4、，解剖鏡下去腦膜，沿中線將大腦半球往外翻開，用纖維鑷小心分離大腦皮層組織，用眼科無齒鑷小心剝?nèi)ツX膜及血管后將大腦皮層組織移至一干凈的培養(yǎng)皿中，加入0.125％的胰蛋白酶消化液3ml剪碎，消化30min，將消化好的細胞碎片移入離心管中，加入種植培養(yǎng)液（含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）終止胰酶作用，5min，重復(fù)2次。用分別套有藍槍頭和黃槍頭的玻璃吸管吹打成單細胞懸液，再分別用100目、200目銅篩濾過，細胞計數(shù)器進行活細胞計數(shù)，按1×1

5、06個/ml種植于24孔板中，每孔加入500μl，放入37℃、5％CO2的孵育箱中孵育2小時后，換成NEUROBASAL培養(yǎng)基+B27按50∶1配制的培養(yǎng)基，以后每兩天換一次培養(yǎng)基。給予劑量75mM的乙醇培養(yǎng)3d、5d、7d后，采用免疫熒光觀察MAP2、TopⅡ2、NURR1蛋白表達情況;Fluoro-Jade B熒光染色觀察神經(jīng)細胞變性壞死情況。
　　2.整體動物模型:健康Wistar孕鼠，體重260±10g。隨機分為空白對照組

6、及灌酒組。用市售白酒紅星二鍋頭5g/kg量制備模型，采用大鼠灌胃器進行灌胃，每天2次，間隔12小時。空白對照組用蒸餾水代替白酒灌胃。實驗前給予適應(yīng)性蒸餾水灌胃5天。從懷孕第6天起開始酒精灌胃，直到孕鼠分娩后，取新生鼠3天、7天、13天大腦各6只及空白對照組3天、7天、13天各6只經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片等處理后經(jīng)免疫組織化學染色觀察大腦皮層神經(jīng)細胞的變化。
　　3.統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示，用

7、SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為有顯著統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:
　　1.細胞實驗（新生鼠大腦皮層原代培養(yǎng)）
　　1.1乙醇對MAP2、TopⅡ2、NURR1表達的影響
　　隨著乙醇染毒時間的延長，MAP2的表達呈現(xiàn)減少趨勢，染毒7天時變化最顯著，與正常

8、對照組相比細胞分布較稀疏，突觸明顯細而短，細胞胞漿內(nèi)紅色熒光信號減弱明顯，陽性表達明顯減少;TopⅡ2、NURR1的表達均隨染毒時間的延長而減少。
　　1.2 Fluoro-Jade B染色觀察神經(jīng)細胞變性壞死情況
　　正常對照組原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞，未見變性壞死陽性細胞;乙醇染毒培養(yǎng)5d組偶見變性壞死陽性細胞，7d組見散在變性壞死陽性細胞
　　2.整體動物實驗（孕期灌酒組新生鼠）
　　2.1 MAP2免疫組織化學染

9、色結(jié)果
　　新生鼠大腦皮層神經(jīng)細胞胞漿及突觸中可見棕褐色顆粒樣的MAP2陽性表達，灌酒組新生鼠生后不同時間大腦皮層陽性表達與正常組相比呈下降趨勢。
　　2.2 TopⅡ2及NURR1免疫組織化學染色結(jié)果
　　新生鼠大腦皮層神經(jīng)細胞胞核可見明顯棕褐色陽性表達，灌酒組新生鼠生后不同時間大腦皮層陽性表達與正常組相比呈下降趨勢。
　　結(jié)論:乙醇的神經(jīng)毒性作用使MAP2、TopⅡ2、NURR1表達降低，提示乙醇影響了神經(jīng)細