小鼠胚胎階段大腦皮層神經(jīng)發(fā)生過(guò)程的研究.pdf

1、在生命發(fā)育的過(guò)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常有序的構(gòu)建是形成高級(jí)生命所必須的。以小鼠為模型，在胚胎時(shí)期，位于大腦皮層內(nèi)側(cè)側(cè)腦室周圍區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)不斷的增殖，分化，遷移等過(guò)程以“inside-to-outside”的方式形成了包含6層不同類型神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜的初級(jí)大腦結(jié)構(gòu)。
　　神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)被定義為能夠生成神經(jīng)組織或者是來(lái)源于神經(jīng)系統(tǒng)中，可以自我更新的多能性干細(xì)胞，其在胚胎發(fā)育過(guò)程中

2、產(chǎn)生多種類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。一些神經(jīng)干細(xì)胞在成年脊椎動(dòng)物的大腦中持續(xù)存在，在整個(gè)生命進(jìn)程中持續(xù)產(chǎn)生新生的神經(jīng)元。干細(xì)胞區(qū)別于其他成體細(xì)胞的特征在于其分化成多種細(xì)胞類型的能力。干細(xì)胞經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。在對(duì)稱細(xì)胞分裂中，兩個(gè)子細(xì)胞也是干細(xì)胞。在不對(duì)稱分裂中，干細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)走向分化方向的細(xì)胞。在發(fā)育的過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞主要分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。具體而言，在小鼠胚胎發(fā)育時(shí)期，神經(jīng)干細(xì)胞

3、主要位于皮層區(qū)域兩個(gè)發(fā)生區(qū)域，側(cè)腦室區(qū)域(Ventricular zone，VZ)和側(cè)腦室下區(qū)域(Subventricular zone，SVZ)，而且處于不同位置的神經(jīng)干細(xì)胞的種類是不一樣的。在側(cè)腦室區(qū)域的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(Radial glial cells，RGs)通過(guò)對(duì)稱分裂完成神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新，形成新的子代RGs，或者通過(guò)不對(duì)稱分裂形成神經(jīng)系統(tǒng)的中間祖細(xì)胞（Intermediate Progenitor cells，IPs）

4、細(xì)胞;位于側(cè)腦室下區(qū)域的IPs細(xì)胞通過(guò)對(duì)稱分裂形成神經(jīng)元，這些神經(jīng)元沿著RG細(xì)胞的放射狀突起不斷地向上遷移成熟到達(dá)特定的區(qū)域形成完整的大腦皮層。在這一系列的變化過(guò)程中，不同的轉(zhuǎn)錄因子按照時(shí)間和空間的先后順序不斷地激活(Pax6-Tbr2-Tbr1-Cux1-Satb2)，精確地調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)。大腦皮層構(gòu)建過(guò)程中的任何一個(gè)步驟發(fā)生問(wèn)題都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育疾病，比如精神分裂癥，自閉癥等。但是，目前對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞增殖，分化，遷移的深入機(jī)制

5、還不十分清楚，需要進(jìn)一步地探究。
　　在胚胎大腦皮層發(fā)育的過(guò)程中，各種形式的表觀遺傳調(diào)控發(fā)揮著重要的功能，比如組蛋白的甲基化，乙?；?，磷酸化;DNA的甲基化;microRNA等等。在這些表觀遺傳修飾中，組蛋白變異體是一個(gè)很大的家族，包含H2A.Z，H2A.X，macroH2A，H3.3等。在實(shí)驗(yàn)體系中，重點(diǎn)關(guān)注了H3.3這種非常關(guān)鍵的組蛋白變異體對(duì)神經(jīng)發(fā)生過(guò)程的影響。真核生物的核小體由不同種類的組蛋白構(gòu)成，包含H1，H2A，H2B

6、，H3和H4。在基因轉(zhuǎn)錄激活或是抑制的過(guò)程中核小體中的組蛋白構(gòu)成會(huì)發(fā)生變化，比如在轉(zhuǎn)錄活化時(shí)，H2A.Z和H3.3會(huì)替換到核小體內(nèi)，形成一種染色體活化的標(biāo)志物，影響蛋白和DNA在染色質(zhì)水平的可接近性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。組蛋白變異體在基因組中的特定區(qū)域發(fā)揮對(duì)基因的表達(dá)的調(diào)控功能。對(duì)這些復(fù)雜的有組蛋白變異體參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究有助于更深入了解基因的表達(dá)過(guò)程。同時(shí)，將對(duì)組蛋白變異體的探索引入到胚胎早期神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的研究中，可以幫助人們從一

7、個(gè)新的角度揭示它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中的重要作用。以往的研究表明H3.3可以通過(guò)替換H3來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，這時(shí)染色體處于一種轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。H3.3上包含豐富的表觀遺傳修飾位點(diǎn)，可以發(fā)生不同的表觀遺傳修飾，進(jìn)一步調(diào)控不同生命發(fā)育過(guò)程。研究結(jié)果表明H3.3在胚胎早期神經(jīng)干細(xì)胞中有表達(dá):在體內(nèi)和體外，H3.3都會(huì)和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物共標(biāo)，而且H3.3的表達(dá)在時(shí)間和位置上有一定的特異性。進(jìn)一步體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H3.3敲降后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增

8、殖的比例減少，分化的神經(jīng)元的比例增加。通過(guò)進(jìn)一步的探索，發(fā)現(xiàn)H3.3的減少會(huì)導(dǎo)致另一種組蛋白修飾H4K16ac的減少，而這是因?yàn)镠3.3表達(dá)量的降低會(huì)減少其對(duì)H4K16位點(diǎn)特異性乙?；D(zhuǎn)移酶的招募，從而降低了H4K16ac的水平并且影響了基因的轉(zhuǎn)錄活化。這提示在神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中H3.3和H4K16ac這兩種組蛋白密碼相互協(xié)同，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在H3.3敲降影響了大量神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的生物過(guò)程。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)后

9、發(fā)現(xiàn)，GLI(GLI-Kruppel)家族的所有基因都是降低的，而其中GLI1減少的最多。通過(guò)進(jìn)一步的Western和小鼠體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)證明GLI1是H3.3的下游基因，其在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。
　　在大腦皮層發(fā)育的過(guò)程中谷氨酸是一種必不可少的氨基酸，發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，谷氨酸的受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體。代謝型谷氨酸受體被報(bào)道與神經(jīng)疾病相關(guān)，是一些神經(jīng)疾病的靶點(diǎn)，可以

10、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元的興奮性。不同的代謝型的谷氨酸受體主要因?yàn)槠涞鞍仔蛄?，功能，配體的不同被區(qū)分為3類。其中包括Ⅰ(GRM1and GRM5)，Ⅱ(GRM2and GRM3)，和Ⅲ(GRM4，GRM6，GRM7，and GRM8)。在分析了以往的報(bào)道后，發(fā)現(xiàn)代謝型谷氨酸受體7（GRM7）作為一種僅在神經(jīng)元突觸前膜上特異性表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體，在接收到谷氨酸的刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑制性的作用。而且有報(bào)道稱GRM7可能與新生兒自閉癥（Auti

11、sm Spectrum，ASD）和注意力缺陷(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)相關(guān)。但是GRM7是否會(huì)影響胚胎時(shí)期大腦皮層的發(fā)育還是未知的。
　　在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在胎鼠大腦皮層內(nèi)過(guò)表達(dá)和敲降GRM7的方法來(lái)研究GRM7在神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRM7在神經(jīng)干細(xì)胞中有表達(dá):在體內(nèi)或體外的染色結(jié)果都表明GRM7和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物共標(biāo)，而且GRM7在不同發(fā)育

12、時(shí)期的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的。進(jìn)一步體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GRM7敲降會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增殖的比例增加，而神經(jīng)元分化的比例減少，而且神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育也會(huì)受到影響。在機(jī)制上的研究表明，在GRM7的表達(dá)受到影響后會(huì)改變CREB(cAMP Responsive Element Binding Protein)蛋白的磷酸化水平，而p-CREB作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子會(huì)影響下游基因的表達(dá)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明YAP(Yes Associated Protein)