Brd2基因的探針制備及其在小鼠大腦皮層的形態(tài)學(xué)研究.pdf

1、目的：為了觀察溴結(jié)構(gòu)域包含蛋白2（Bromodomain containing protein2，Brd2）基因在小鼠大腦皮層的表達(dá)分布并系統(tǒng)了解其神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)，本研究首先制備兩條地高辛標(biāo)記的Brd2 cRNA反義探針。并且應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)驗(yàn)證兩條探針的檢測效果，之后選用其中一條探針觀察和分析Brd2 mRNA在C57BL/6小鼠大腦皮層組織的表達(dá)與神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)首先提取小鼠大腦皮層組織總RNA，設(shè)計(jì)兩對Br

2、d2引物，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法，得到兩個Brd2基因的目的DNA片段，并將其分別克隆到pCRⅡ-TOPO載體中，根據(jù)載體上T7和SP6啟動子位點(diǎn)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成兩條地高辛標(biāo)記的cRNA反義探針，應(yīng)用熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩條探針的特異性并觀察其在腦組織切片中的雜交效果。本實(shí)驗(yàn)將12只健康成年C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組，第一組小鼠灌注取材切片，應(yīng)用熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測Brd2基因在小鼠大腦皮層組織中的表達(dá)特點(diǎn)；第

3、二組小鼠腦組織切片則采用熒光原位雜交結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)染色的方法觀察與分析小鼠大腦皮層組織中Brd2 mRNA陽性細(xì)胞的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)。
　　結(jié)果：（1）本研究應(yīng)用分子神經(jīng)生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了兩個Brd2/pCRⅡ-TOPO質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得了兩條較高效價(jià)的地高辛標(biāo)記的cRNA反義探針，在熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用兩條探針顯示出較好的雜交效果。
　　（2）選擇兩條探針中的一條進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，觀察和分析Brd2 mRN

4、A在C57BL/6小鼠大腦皮層組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在小鼠大腦皮層組織中，Brd2 mRNA存在不同強(qiáng)度的表達(dá)，而且主要表達(dá)于神經(jīng)元所在的部位。
　　（3）采用熒光原位雜交結(jié)合免疫熒光雙重標(biāo)記染色的方法觀察Brd2 mRNA陽性細(xì)胞與神經(jīng)元核蛋白（NeuN），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），γ-氨基丁酸（GABA），維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白（CB），鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）和小白蛋白（PV）在小鼠大腦皮層組織中的表達(dá)類型與共存情況。

5、結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠大腦皮層組織中Brd2 mRNA陽性細(xì)胞主要表達(dá)分布于NeuN陽性的神經(jīng)元中，而GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)Brd2 mRNA。在小鼠大腦皮層組織中，Brd2 mRNA與GABA、CB、CR和PV均有共存。其中Brd2/GABA共存細(xì)胞占Brd2 mRNA陽性細(xì)胞的18％，占GABA陽性細(xì)胞的52%；Brd2/CB共存細(xì)胞占Brd2 mRNA陽性細(xì)胞的23%，占CB陽性細(xì)胞的82%；Brd2/CR共存

6、細(xì)胞占Brd2 mRNA陽性細(xì)胞的20%，占CR陽性細(xì)胞的82%；Brd2/PV共存細(xì)胞占Brd2 mRNA陽性細(xì)胞的13%，占PV陽性細(xì)胞的31%。
　　結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)制備的地高辛標(biāo)記的cRNA反義探針可特異地檢測Brd2 mRNA在大腦皮層組織中的表達(dá)。
　?。?）Brd2 mRNA在C57BL/6小鼠大腦皮層組織中廣泛表達(dá)，并且主要表達(dá)于神經(jīng)元中，星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)Brd2 mRNA。
　?。?）較系統(tǒng)地