谷氨酸誘導(dǎo)小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放路徑的研究.pdf

1、前言
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞再生、免疫調(diào)節(jié)、參與信號(hào)傳導(dǎo)、參與疼痛調(diào)節(jié)機(jī)制等中起到重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在著密切的機(jī)構(gòu)和功能聯(lián)系，通過(guò)神經(jīng)元興奮釋放的遞質(zhì)可作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后也釋放遞質(zhì)作用于神經(jīng)元，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和突觸傳遞。其中主要的神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸與ATP。
　　谷氨酸是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是谷氨酸攝取、

2、代謝、和循環(huán)的主要場(chǎng)所，通過(guò)對(duì)谷氨酸的釋放與重吸收來(lái)維持胞外的相對(duì)低濃度，以利于突觸間興奮性的傳遞。但是在腦缺血、缺氧、腦外傷、腦水腫等病理?xiàng)l件下，會(huì)造成細(xì)胞外高濃度的谷氨酸，產(chǎn)生谷氨酸的興奮性毒性，加劇細(xì)胞和組織的損傷，導(dǎo)致不良結(jié)果。
　　ATP是細(xì)胞內(nèi)的供能物質(zhì)，也是重要的神經(jīng)遞質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的ATP釋放涉及到一系列的神經(jīng)元的活動(dòng)，并且也對(duì)自身產(chǎn)生一定的影響。在水腫、機(jī)械刺激、谷氨酸和NO刺激等條件下都會(huì)發(fā)生星形膠質(zhì)細(xì)胞的A

3、TP釋放。研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在低滲或缺血缺氧等條件下，會(huì)出現(xiàn)大量的ATP的釋放和胞外高濃度聚集，并參與繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死。
　　ATP和谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動(dòng)中，既有各自的作用途徑和環(huán)節(jié)，又有緊密的相互關(guān)系，相互影響。既往有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP或谷氨酸在各種生理或病理情況下對(duì)細(xì)胞功能活動(dòng)的影響研究比較多，但二者之間的相互作用關(guān)系卻很少有報(bào)道。所以本研究中，分別觀察不同濃度谷氨酸刺激條件下細(xì)胞外液中ATP的濃度變化，明確

4、其釋放途徑，并進(jìn)一步觀察細(xì)胞外液中ATP變化對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。尋找有效的方法減少該條件下細(xì)胞內(nèi)ATP的外流，減少谷氨酸和ATP共同作用所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的損傷。
　　方法
　　采用原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，①分成三組:A對(duì)照組;B谷氨酸處理組(再分為谷氨酸濃度不同的亞組，分別加入谷氨酸0.1mM，0.3mM，1.0mM);C谷氨酸處理+ATP釋放途徑抑制劑組（再分為抑制不同ATP釋放途徑的幾個(gè)亞組，分別加

5、入VSOR氯離子通道抑制劑DCPIB10μM;大陰離子通道抑制劑氯化釓50μM;半通道抑制劑carbenoxolone100μM（同時(shí)亦作用于pannexins）;囊泡介導(dǎo)途徑抑制劑BFA5μM和P2X7受體抑制劑考馬斯亮蘭G1μM)。于加入谷氨酸前，加入谷氨酸后3min，5min，15min，30min，1hr，2hr，4hr，6hr收集細(xì)胞外液檢測(cè)ATP濃度。②分為A對(duì)照組;B谷氨酸處理組（谷氨酸終濃度為0.3mM）C谷氨酸處理+A

6、TP釋放途徑抑制劑組氯化釓50μM，在特定的時(shí)間點(diǎn)0h、2h、6h、12h、24h吸取細(xì)胞外液進(jìn)行LDH釋放的測(cè)定，來(lái)觀察細(xì)胞膜的完整性。③分為A對(duì)照組;B谷氨酸處理組（谷氨酸終濃度為0.3mM）;C谷氨酸處理+ATP釋放途徑抑制劑組氯化釓50μM組，在特定的時(shí)間點(diǎn)0h、2h、6h、12h、24h用Hoechst-PI雙染色法檢測(cè)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。多組資料采

7、用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1、谷氨酸引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放
　　培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞外液中基礎(chǔ)量的ATP（5.941±0.740nM），當(dāng)加入0.1mM，0.3mM，1.0mM谷氨酸后，3min時(shí)引起ATP釋放的增加，大約在5min時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，細(xì)胞外液ATP濃度能達(dá)到基礎(chǔ)量的1.5～2倍，與谷氨酸的濃度成正相關(guān)。之后ATP的濃度回落到基礎(chǔ)值，但是在連續(xù)

8、處理1hr時(shí)又會(huì)出現(xiàn)第二個(gè)小峰值。與對(duì)照組細(xì)胞相比，1.0mM谷氨酸組在3min、5min、15min、60min能促進(jìn)ATP釋放的增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;0.3mM組在3min、5min、15min具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;0.1mM組在5min時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、谷氨酸誘導(dǎo)的ATP釋放途徑研究。
　　VSOR氯離子通道抑制劑DCPIB10μM、半通道抑制劑carbenoxolone100μM、囊泡介導(dǎo)途徑抑制劑BFA5μM和P

9、2X7受體抑制劑考馬斯亮蘭G（1μM）均不能阻滯谷氨酸引起的ATP釋放，與谷氨酸處理組相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　大陰離子通道抑制劑氯化釓50μM能夠抑制谷氨酸引起的ATP釋放，與谷氨酸處理組相比，在3min、5min、1hr這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)能抑制谷氨酸引起ATP的釋放，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、谷氨酸引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的檢測(cè)。
　　①LDH釋放:與對(duì)照組相比，6hr之內(nèi)，谷氨酸處理組與抑制劑組差異沒(méi)有

10、顯著性;但是12hr時(shí)谷氨酸處理組與抑制劑組LDH釋放增加;24hr時(shí)與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制劑組的凋亡率低于單純谷氨酸處理組。
　?、贖oechst-PI雙染:在6hr之內(nèi)，各組細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有明顯改變，12hr之后谷氨酸組陽(yáng)性細(xì)胞所占比例增加，24hr時(shí)損傷加重，加入抑制劑組損傷較谷氨酸組損傷輕。
　　1、大陰離子通道是谷氨酸誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP的重要途徑。
　　2、通過(guò)抑制谷氨酸誘導(dǎo)的ATP的釋放