嗅覺系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生過程的機(jī)制研究.pdf

1、成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)損傷后神經(jīng)再生能力非常有限，但嗅覺系統(tǒng)是一個特例。在嗅覺系統(tǒng)中，嗅神經(jīng)元(olfactory receptorneurons，ORNs)可以終生不斷更新替換，是研究神經(jīng)發(fā)生的一個理想模型[1][2][3][4]。目前，關(guān)于嗅覺系統(tǒng)為什么會終生具有再生能力；ORNs為什么可以終生不斷更新替換；在嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生過程中，嗅鞘細(xì)胞(olfactory enshe

2、athing cells，OECs)如何從嗅上皮向嗅球內(nèi)遷移的；嗅神經(jīng)軸突是如何從嗅上皮長入嗅球的；OECs與ORNs之間是如何相互作用的；嗅神經(jīng)軸突投射到嗅球后是如何進(jìn)行分選定位的，等等諸多問題都還不清楚。深入研究嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生過程將有助于人們深入了解嗅覺系統(tǒng)發(fā)育和嗅覺可塑性的機(jī)理，為探索成年哺乳動物CNS不可再生的原因、尋找中樞神經(jīng)損傷新的治療策略提供重要的理論依據(jù)。本研究應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)手段，主要探討嗅覺系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制問題，主

3、要包括以下兩個方面的內(nèi)容：
　　 1、嘌呤能信號分子(purinergic signaling)抑制嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathing cells，OECs)遷移
　　 成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以后再生極為困難，功能恢復(fù)極為有限。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，嗅神經(jīng)是一類比較特殊的神經(jīng)，嗅受體神經(jīng)元終生可以不斷再生。一般認(rèn)為，成年后嗅神經(jīng)之所以能夠終生再生可能與該系統(tǒng)內(nèi)嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheath

4、ing cells，OECs)這一類特殊膠質(zhì)細(xì)胞的存在有密切關(guān)系[5][6]。OECs是嗅覺系統(tǒng)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它同時具有雪旺細(xì)胞(提供軸突再生微環(huán)境及髓鞘化作用)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較好的相容性)的特性，是目前已知唯一能同時存在于中樞(嗅球)和外周(嗅上皮)神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞[7][8][9]。OECs作為嗅神經(jīng)的成鞘細(xì)胞，在神經(jīng)發(fā)生過程中，它起源于嗅上皮，包裹嗅神經(jīng)軸突束并沿著該軸突遷移，支持和引導(dǎo)它們從外周穿越篩骨

5、板長入位于中樞的嗅球[7][10][11][12]。嗅鞘細(xì)胞具有促進(jìn)嗅神經(jīng)軸突生長、導(dǎo)向以及再生的能力。研究表明，嗅鞘細(xì)胞的遷移對嗅覺系統(tǒng)發(fā)育具有關(guān)鍵性意義。在嗅覺系統(tǒng)發(fā)育過程中，嗅神經(jīng)元的遷移，軸突的生長、再生與靶向等一系列活動，都與嗅鞘細(xì)胞的定向遷移及遷移距離密切相關(guān)[13][14][15]。然而，目前國際上對嗅鞘細(xì)胞遷移的具體調(diào)控機(jī)制了解還十分有限。
　　 嘌呤能信號分子作為一種信號分子，在細(xì)胞的信號傳遞中起重要作用。目前

6、，ATP的生理或病理來源問題已經(jīng)被清楚的闡明了[16][17][18][19]。據(jù)報道，嗅覺系統(tǒng)中的ATP是以囊泡的方式由ORNs釋放[19][20][21][22][23][24]。嘌呤能信號分子參與了膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移過程。已有研究表明，嘌呤能信號分子可以作為“宿主組織損傷信號”(host tissue damage signaling)影響細(xì)胞的遷移[25]。也曾有報道稱，在嗅神經(jīng)元損傷時嗅上皮(olfactory epithe

7、lium，OE)中嘌呤能信號可誘導(dǎo)介導(dǎo)的熱激蛋白的表達(dá)，起神經(jīng)保護(hù)作用。但是嘌呤能信號是否在成體OE的神經(jīng)發(fā)生過程中對嗅鞘細(xì)胞的遷移起作用，目前仍未見報道。
　　 本研究探討了在嗅覺系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生過程中嘌呤能信號分子的釋放對OECs遷移的影響。首先，我們應(yīng)用細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)和Boyden chamber細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，證明嘌呤能信號分子可以抑制體外培養(yǎng)的OECs的遷移。進(jìn)一步采用免疫熒光染色和RT-PCR的方法，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的OEC

8、s上表達(dá)嘌呤能受體P2Y1和P2Y2，而不表達(dá)其他亞型的嘌呤能受體。采用嘌呤能受體的拮抗劑阻斷嘌呤能信號分子與其受體的結(jié)合，可以明顯地減輕嘌呤能信號分子對OECs遷移的抑制作用。這提示嘌呤能信號分子抑制OECs遷移的作用應(yīng)該是由P2Y1和P2Y2受體介導(dǎo)的。這些結(jié)果表明，嘌呤能信號分子可以作用于嗅鞘細(xì)胞上的P2Y1和P2Y2受體，從而抑制嗅鞘細(xì)胞遷移。通過本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)了調(diào)控嗅鞘細(xì)胞遷移的一個新的機(jī)制，這有助于加深人們對嗅鞘細(xì)胞

9、和嗅受體神經(jīng)元相互作用機(jī)理的認(rèn)識，為深入了解神經(jīng)發(fā)育和再生的機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)，為尋找中樞神經(jīng)疾病和損傷的有效治療策略和治療靶標(biāo)提供了新的突破口。
　　 2、HDACs在嗅上皮神經(jīng)發(fā)生過程中的作用及其機(jī)制研究
　　 嗅上皮的神經(jīng)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)制，是嗅覺發(fā)育生物學(xué)的重要問題。嗅受體神經(jīng)元是嗅覺系統(tǒng)的一級神經(jīng)元，也是唯一存在于嗅上皮的神經(jīng)元[26]。它接受外界氣味分子刺激，并將信號向上傳遞至嗅覺中樞。ORNs是脊椎

10、動物中唯一與外周環(huán)境直接接觸的神經(jīng)元，這一特點(diǎn)使得ORNs極易受到損傷。因此，ORNs的發(fā)生對于維持動物正常的嗅覺功能是非常重要的。哺乳動物的ORNs終生都處在不斷地再生過程中。嗅上皮神經(jīng)發(fā)生是一個極其復(fù)雜的過程，ORNs發(fā)育的每個階段都受到相應(yīng)的調(diào)控，但是迄今為止并不清楚這一重要過程的調(diào)控機(jī)制。
　　 染色體核心組蛋白的乙?；腿ヒ阴；瘜M蛋白調(diào)控作用極其重要，可以影響增殖、分化及基因沉默等很多生物學(xué)過程。調(diào)控組蛋白乙?；揎?/p>

11、過程的組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)，在神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、命運(yùn)決定、分化等多個過程[27][28][29]。2005年，MacDonald等人的研究顯示，在嗅上皮干細(xì)胞和嗅受體神經(jīng)元中有HDACs的表達(dá)[30]。這提示，HDACs有可能參與了嗅覺發(fā)生的過程，但是目前尚無這方面的報道。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HDACs參與了嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生過程。首先

12、，我們通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HDACs的抑制劑可以降低嗅上皮厚度和細(xì)胞總數(shù)。為了探討HDACs與嗅上皮細(xì)胞增殖的關(guān)系，我們采用了BrdU染色，結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)，經(jīng)HDACs抑制劑處理后，嗅上皮的細(xì)胞增殖受到了抑制。為了探討HDACs與嗅上皮神經(jīng)元成熟的關(guān)系，我們采用在體實(shí)驗(yàn)和蛋白印記的方法，發(fā)現(xiàn)HDACs抑制劑可以使小鼠嗅上皮中OMP陽性的嗅神經(jīng)元數(shù)目減少且OMP的表達(dá)減少，并且HDACs這種影響嗅上皮細(xì)胞的增殖的作用是通過Notch

13、2信號通路起作用的。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示，HDACs具有通過Notch2信號通路調(diào)控嗅上皮的細(xì)胞增殖和嗅神經(jīng)元的成熟的作用，HDACs活性被抑制將導(dǎo)致嗅上皮細(xì)胞增殖的減弱、嗅神經(jīng)元的成熟被抑制，從而影響嗅上皮的正常形態(tài)，導(dǎo)致其厚度降低、細(xì)胞總數(shù)減少。本研究不僅為嗅覺系統(tǒng)的正常構(gòu)建和維持提供了新的分子機(jī)制，而且為深入了解神經(jīng)發(fā)育和再生的機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。
　　 本研究的主要發(fā)現(xiàn)總結(jié)如下：
　　 1.在成體嗅神經(jīng)發(fā)生過程中