精神疾病易感基因NPAS3對VGF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其在神經(jīng)發(fā)生過程中的分子機制.pdf

1、目的：尋找精神疾病易感基因 NPAS3調(diào)控 VGF的具體分子機制，并探究二者在神經(jīng)細胞增殖過程中的作用，及此過程的潛在分子機制。
　　方法：采用lipofectamine3000轉(zhuǎn)染真核表達載體、短發(fā)夾RNA或小干擾RNA，達到過表達或敲低NPAS3與VGF的目的。免疫熒光技術檢測大鼠海馬中NPAS3與 VGF的表達位置。利用大鼠神經(jīng)干細胞作為體外模型，qPCR及 Western blot分別檢測mRNA和蛋白水平NPAS3對VG

2、F的調(diào)控。構建缺失κB結(jié)合位點的VGF啟動子，熒光素酶報告基因檢測不同NPAS3水平下，全長（1237bp）及截短（990bp） VGF啟動子的的活性。使用NF-κB抑制劑Caffeic Acid Phenethyl Ester（CAPE）刺激細胞或/和改變NPAS3表達含量，Western blot檢測不同處理下VGF、NF-κB p65、NF-κB p52的蛋白水平變化。給及細胞不同處理，CCK8檢測各組細胞增殖程度。Western

3、 blot檢測過表達NPAS3和/或使用代謝型谷氨酸受體5（mGluR5）抑制劑2-methyl-6-（phenylethynyl）-pyridine（MPEP）、敲低 VGF和/或過表達 NPAS3后，下游分子蛋白激酶 D（PKD）的磷酸化水平。通過過表達 NPAS3和/或使用N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA受體）（離子型谷氨酸受體之一）抑制劑Dizocilpine（MK-801）、敲低VGF和/或過表達NPAS3 Western

4、 blot方法檢測鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）的活化程度。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染過表達 NPAS3質(zhì)粒 pcDNA3.1-NPAS348小時后，293T細胞中NPAS3蛋白含量明顯升高；轉(zhuǎn)染四種小干擾RNA質(zhì)粒敲低NPAS3，Western blot結(jié)果表明敲低效果明顯，其中NPAS3-sh-892質(zhì)粒效果最好，用于后續(xù)實驗。免疫熒光結(jié)果顯示 NPAS3與 VGF定位重合，主要分布于海馬體齒狀回顆粒細胞下層及顆粒細胞層

5、。在大鼠神經(jīng)干細胞中，qPCR結(jié)果表明過表達NPAS3可以上調(diào)VGF的轉(zhuǎn)錄（P<0.01）；相反，敲低NPAS3蛋白VGF的轉(zhuǎn)錄水平顯著減弱（P<0.01），此結(jié)果與前期基因芯片結(jié)果一致。在蛋白水平上，過表達 NPAS3蛋白后 VGF蛋白明顯升高（P<0.001），而下調(diào) NPAS3水平后，VGF也隨之下降（P<0.01）。熒光素酶報告基因檢測NPAS3不同水平下，VGF啟動子活性強弱，結(jié)果顯示：無論VGF啟動子上是否含有κB結(jié)合位點，

6、高表達NPAS3都能激活VGF啟動子，但是含有κB結(jié)合位點的VGF啟動子（1237bp）的活性顯著強于缺失κB結(jié)合位點的VGF啟動子（990bp）（P<0.01）；相反，敲低NPAS3后，與對照組相比，VGF啟動子的活性雖然減弱，但含有κB結(jié)合位點的VGF啟動子（1237bp）活性依然強于缺失κB結(jié)合位點的VGF啟動子（990bp）（P<0.05），說明NPAS3可以通過VGF啟動子上的κB位點增強其活性。通過使用CAPE，進一步檢測V

7、GF及NF-κB家族成員p65、p52蛋白水平變化，western blot結(jié)果顯示當使用CAPE后VGF表達降低（P<0.001）；與DMSO組相比，過表達NPAS3促進VGF表達的作用可以被CAPE拮抗（P<0.01）；對于NF-κB p65蛋白，上調(diào)NPAS3的含量可以促進其表達的水平，而且使用CAPE后，其變化水平與VGF變化基本一致；而p52的蛋白含量在各種處理下則沒有相應的變化趨勢，說明NPAS3可以通過p65間接影響VGF

8、的表達。CCK8結(jié)果表明，在神經(jīng)細胞系中，NPAS3可以促進細胞增殖（P<0.05）；敲低 VGF后，與對照組比較發(fā)現(xiàn)細胞增殖程度呈現(xiàn)減弱的趨勢，過表達 NPAS3同時敲低VGF較敲低VGF組細胞增殖明顯增強（P<0.05）。分析NPAS3促進細胞增殖的分子機制，在mGluR5通路中，PKD的含量可以被NPAS3調(diào)節(jié)（P<0.001）；使用MPEP后，與DMSO組相比，磷酸化PKD水平降低（P<0.05），而過表達NPAS3同時給予MP

9、EP刺激后，PKD磷酸化水平不再升高，說明NPAS3通過mGluR5調(diào)控PKD；敲低VGF后，磷酸化PKD含量降低（P<0.001），而與對照組相比，過表達NPAS3同時敲低VGF后，磷酸化PKD仍然顯著下降（P<0.001），說明NPAS3通過 VGF激活 mGluR5調(diào)控下游分子 PKD。同時，檢測 NMDA受體通路，與mGluR5結(jié)果一致，過表達NPAS3含量能促進CaMKII的磷酸化（P<0.001），而此效應可被NMDA受體抑

10、制劑Dizocilpine MK-801所拮抗；同樣，敲低VGF可減少磷酸化CaMKII的含量，而過表達NPAS3也不能扭轉(zhuǎn)此現(xiàn)象（P<0.001）。
　　結(jié)論：1、精神疾病易感基因NPAS3與神經(jīng)營養(yǎng)誘導因子VGF共定位于大鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層及顆粒細胞層。
　　2、在大鼠神經(jīng)干細胞中，NPAS3可以調(diào)控VGF的轉(zhuǎn)錄與表達。
　　3、NPAS3可以通過NF-κB（p65）通路調(diào)控VGF。
　　4、NPAS3