鎮(zhèn)痛藥對(duì)細(xì)胞縫隙連接功能的作用及其對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響研究.pdf

1、研究背景 鎮(zhèn)痛藥廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤，特別是手術(shù)后和晚期腫瘤病人的麻醉及疼痛治療，因此，在臨床上常與抗腫瘤藥同時(shí)使用。但是，至今為止有關(guān)鎮(zhèn)痛藥對(duì)抗腫瘤藥物療效影響的研究報(bào)道很少。順鉑作為臨床上常用的廣譜化療藥，對(duì)睪丸癌、卵巢癌、肺癌和頭頸部癌等實(shí)體瘤都有很好的療效，是多種腫瘤化療方案中的組成藥物。使用順鉑進(jìn)行化療的腫瘤病人，在用鎮(zhèn)痛藥進(jìn)行麻醉及鎮(zhèn)痛時(shí)，是否對(duì)其療效產(chǎn)生影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。 目前對(duì)鎮(zhèn)痛藥的作用機(jī)制較多集中于

2、神經(jīng)突觸及其相關(guān)離子通道的研究，而對(duì)鎮(zhèn)痛藥影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的作用及意義缺乏深入的研究和了解。有研究表明，鎮(zhèn)痛藥對(duì)細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)介導(dǎo)的細(xì)胞問(wèn)通訊(gapjunctional intercellular communication，GJIC) 的影響可能是其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制之一。 GJ 是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器(如心臟，肝臟，腎臟，中樞神經(jīng)，皮膚，肌肉等)組織中，由特殊的通

3、道蛋白——連接蛋白(connexin，Cx)組成。6個(gè)Cx環(huán)繞在一起組成一個(gè)“半通道”(hemichannel，又稱為連接子connexon)。兩個(gè)位于各自細(xì)胞胞膜上的“半通道”對(duì)接在一起形成一個(gè)GJ。GJ溝通相鄰細(xì)胞的胞漿，細(xì)胞漿中分子量<1 kDa的物質(zhì)(如離子，細(xì)胞信號(hào)分子和代謝物質(zhì)等)可通過(guò)GJ擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn)到與其毗鄰的細(xì)胞漿。GJ提供了一種細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接聯(lián)系通道，是細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的一種重要方式?，F(xiàn)已證明GJ在同步細(xì)胞的活動(dòng)

4、、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用；GJ異常與許多疾病(包括腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。最近有報(bào)道：在培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，GJ能夠增強(qiáng)多種化學(xué)毒物引起細(xì)胞凋亡的作用。特別指出的是，GJ可增強(qiáng)抗腫瘤藥物順鉑的細(xì)胞毒性。盡管有許多研究探討了鎮(zhèn)痛藥對(duì)GJIC的影響，但結(jié)果并不一致；并且目前的研究只注重GJ與鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛機(jī)制的關(guān)系，對(duì)鎮(zhèn)痛藥能否通過(guò)改變GJIC而影響抗腫瘤藥(如順鉑)的細(xì)胞毒性還未見(jiàn)

5、報(bào)道。本研究擬觀察不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的鎮(zhèn)痛藥(嗎啡、曲馬多和凱紛)對(duì)轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32的Hela細(xì)胞GJIC的作用；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解上述鎮(zhèn)痛藥對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響，以及這種影響是否是通過(guò)改變GJ功能而產(chǎn)生的。 研究目的： 了解鎮(zhèn)痛藥對(duì)GJ功能和順鉑細(xì)胞毒性的影響；并探討鎮(zhèn)痛藥改變GJ功能的作用與其對(duì)順鉑細(xì)胞毒性影響的關(guān)系。為闡明鎮(zhèn)痛藥的作用機(jī)制和順鉑耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理提供資料；為指導(dǎo)腫瘤化療病人合理使用鎮(zhèn)痛藥提供理論基

6、礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 轉(zhuǎn)染并表達(dá)含Cx32的Hela細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選及誘導(dǎo)：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了一系列能夠表達(dá)同質(zhì)性Cx (homomeric，由同一種Cx組成的通道)或異質(zhì)性Cx(heteromeric，由不同Cx組成的通道)的載體質(zhì)粒。這種雙向質(zhì)?？梢栽谝粋€(gè)肩動(dòng)子的控制下同時(shí)表達(dá)任意一種或兩種Cx。Cx的表達(dá)是可以控制的，一般情況下，Cx不表達(dá)；需要表達(dá)時(shí)，先用含G-418、潮霉素的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中加入doxyc

7、ycline引起Cx表達(dá)。這樣，能夠避免因過(guò)度表達(dá)Cx引起的細(xì)胞傷害。 鎮(zhèn)痛藥對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞GJ功能影響測(cè)定：將表達(dá)有Cx32的HeLa細(xì)胞與熒光指示劑Calcine-AM和DiI-CM共同孵育，使Calcine-AM和DiI-CM進(jìn)入細(xì)胞。培養(yǎng)4小時(shí)，待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，計(jì)數(shù)一個(gè)“供體細(xì)胞”周圍含有calcine的“接受細(xì)胞”作為GJ功能指標(biāo)。 鎮(zhèn)痛藥對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響測(cè)定：本研究采用Dr．Glaze

8、r報(bào)道的“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”，測(cè)定順鉑對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)Cx32的HeLa細(xì)胞)的細(xì)胞集落(克隆)形成的影響。細(xì)胞集落形成反映了單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力，能較靈敏地測(cè)定抗癌藥的活性。本實(shí)驗(yàn)以順鉑降低細(xì)胞集落形成率(SurvivingFraction)作為順鉑的細(xì)胞毒性指標(biāo)。用不同密度接種細(xì)胞的方法獲得有GJ形成(已融合)的細(xì)胞和無(wú)GJ形成(未融合)的細(xì)胞。在上述細(xì)胞，觀察GJ形成對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性影響。細(xì)胞集落形成率(Surviving

9、 Fraction)=順鉑處理組的細(xì)胞集落數(shù)/未用順鉑處理組的細(xì)胞集落數(shù)為了避免不同生長(zhǎng)期的細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，細(xì)胞在加入順鉑前24小時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使所有細(xì)胞均同步在G1期。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．嗎啡(10μg/ml)對(duì)表達(dá)Cx32的Hela細(xì)胞GJ功能無(wú)影響。而曲馬多和凱紛(1μg/ml，10μg/ml)對(duì)上述細(xì)胞的 GJ 功能有顯著的抑制作用(P<0.05)，凱紛的抑制作用強(qiáng)于曲馬多和2-AP

10、B(2.3μg/ml)。 2．順鉑(0.5μg/ml)能夠顯著降低表達(dá)Cx32的HeLa細(xì)胞集落形成率。在有GJ形成的細(xì)胞(高密度接種，生長(zhǎng)融合的細(xì)胞)，順鉑的細(xì)胞毒性顯著大于無(wú)GJ形成細(xì)胞(低密度接種，細(xì)胞生長(zhǎng)未融合)。在有GJ的細(xì)胞，用2-APB(2.3μg/ml)抑制GJ，可降低順鉑的細(xì)胞毒性。結(jié)果證明GJ能增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性；抑制GJ可使順鉑的細(xì)胞毒性降低。 3．曲馬多(10μg/ml)無(wú)細(xì)胞毒性。曲馬多和順鉑聯(lián)

11、合使用，在有GJ形成的細(xì)胞，細(xì)胞集落形成率顯著高于順鉑單用組；表明曲馬多能降低順鉑的細(xì)胞毒性。而在無(wú)GJ形成細(xì)胞，曲馬多并不能改變順鉑的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明曲馬多可降低順鉑的細(xì)胞毒性；曲馬多對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響是通過(guò)GJ產(chǎn)生的。 4．在有或無(wú)GJ形成的細(xì)胞，凱紛(10μg/ml)都降低細(xì)胞集落形成率，表明凱紛有一定的細(xì)胞毒性。在有GJ形成的細(xì)胞，凱紛和順鉑聯(lián)合使用組的細(xì)胞集落形成率顯著高于順鉑單用組；表明凱紛能降低順鉑的細(xì)胞毒性。