心肌細胞縫隙連接傳遞大分子物質及其功能.pdf

1、【背景】
　　縫隙連接是位于心肌細胞之間閏盤部位的一種非選擇性物質交換通道，允許小于1 kDa的小分子物質，例如離子、第二信使分子等通透，實現細胞漿的部分物質交換與信息傳遞。近年來隨著對縫隙連接研究的深入，發(fā)現縫隙連接依賴其可以通透物質的特性，參與了多種生理和病理過程，例如縫隙連接可以影響細胞的轉錄翻譯過程，改變蛋白表達水平與種類，促進凋亡信號的擴散，增加心肌梗死面積，影響細胞周期等。用小分子物質的通透很難解釋縫隙連接的這些功能，

2、因此，我們推測縫隙連接的通透特性不僅限于小于1 kDa的物質，此通道可能允許大分子物質的通透。本課題采用多種實驗方法，系統(tǒng)地研究了縫隙連接的通透特性，以及大分子物質通過縫隙連接在細胞間交換的作用。
　　【目的】
　　（1）獲得大量具有功能性縫隙連接的連體心肌細胞。
　?。?）顯微注射檢測心肌細胞縫隙連接的物質通透性，以及通道孔徑。
　?。?）研究縫隙連接對心肌細胞死亡信號和生長信號傳遞的作用。
　　【方法】

3、
　　本研究主要采用顯微注射的方法，將一系列分子量不同、體積不同的熒光分子注入連體心肌細胞內，觀察分子的擴散過程，間接測定心肌縫隙連接的通透性及通道孔徑尺寸。隨后建立在體心肌梗死、離體心肌梗死模型，檢測縫隙連接在細胞序貫死亡中的作用；建立心臟肥大模型、新生大鼠原代心肌細胞肥大模型，檢測縫隙連接在細胞生長中的作用；構建病毒載體，感染心肌細胞，研究大分子物質經縫隙連接在培養(yǎng)細胞間的擴散過程與作用。
　　【結果】
　?。?）

4、改進實驗方法，獲得具有功能性縫隙連接的連體心肌細胞
　　酶消化法急性分離成年大鼠心肌細胞，可以獲得大量高質量的單個長桿狀心肌細胞，縫隙連接結構與功能均遭到破壞，不能滿足本實驗的要求。為了獲得與生理狀態(tài)基本一致的縫隙連接，本研究通過改變酶消化過程中液體 Ca2+濃度，增加液體中Ca2+濃度，并在5~10μmol/L范圍內微調，同時全程維持液體的pH值（7.35~7.45）在恒定范圍，可以使部分閏盤在消化過程中保持完整，消化結束后獲得

5、大量的連體心肌細胞。顯微注射熒光分子碘化丙啶（PI，分子量668 Da）和縫隙連接阻斷劑octanol孵育細胞，兩個實驗證實連體心肌細胞間的縫隙連接功能正常，沒有受到酶消化處理的影響產生功能失調，因此可以采用酶消化法獲得的連體心肌細胞，針對縫隙連接的結構與功能開展下一步的研究。
　?。?）縫隙連接可以通透大分子物質，但是對物質的通透性受到多種因素的影響
　　免疫熒光方法確定心室肌表達的縫隙連接蛋白（connexin）亞型包括

6、Cx40、Cx43、Cx45，心室肌縫隙連接是由12個connexin亞基組成的異源復合體。在現有的實驗方法不能直接檢測心肌細胞縫隙連接通透性的情況下，本課題采用顯微注射熒光分子的方法間接測定縫隙連接的通透性。分別向一個心肌細胞內注射熒光分子10 kDa、40 kDa、70 kDa、150 kDa、250 kDa或2000 kDa的Dextran-FITC，熒光顯微鏡觀察熒光分子在連體細胞間的擴散過程，證實縫隙連接可以通透小于150 k

7、Da的Dextran-FITC，但是隨著分子量的增加，熒光分子的擴散速度越來越慢，說明分子量的大小影響物質的通透性；為觀測蛋白分子的擴散特性，顯微注射紅色熒光蛋白(RFP)進入細胞，發(fā)現RFP也可以順利通過縫隙連接，但是擴散速度遠遠慢于同等分子量的Dextran-FITC，說明物質的電荷數和空間構象也會對物質的通透性產生影響。根據已知熒光分子Dextran-FITC的直徑，可以估測出心肌縫隙連接的孔徑約為17 nm。
　?。?）縫

8、隙連接可以介導死亡信號和細胞生長信號的傳導
　　縫隙連接可以促進死亡信號的擴散。分別構建在體、離體心肌梗死模型，本研究發(fā)現在心肌梗死危險區(qū)，縫隙連接保持開放，會導致死亡信號從壞死心肌細胞蔓延至存活心肌細胞，細胞結構首先從一端開始破壞，出現肌節(jié) Z線附近電子密度降低，線粒體腫脹，肌纖維斷裂，逐漸向整個細胞擴散，最終導致整個細胞壞死。再灌注損傷過程中多種因素（缺氧、鈣超載、酸中毒）會降低縫隙連接的通透性，促進縫隙連接關閉，可以阻斷死亡

9、信號的傳遞，使存活的心肌細胞得以保持活性，減少死亡細胞數量，降低心肌梗死面積。
　　縫隙連接可以介導生長信號的傳遞。建立心臟壓力后負荷模型-腹主動脈縮窄，分別觀察1d、8W、16W的心肌肥厚程度，發(fā)現閏盤雙側的心肌細胞生長速度保持一致；肥大因子ET-1刺激新生大鼠原代培養(yǎng)細胞，48 h測定細胞表面積，重點測定保持相互接觸的細胞面積，因為這類細胞之間存在縫隙連接，發(fā)現相互接觸的細胞表面積沒有差異，沒有相互接觸的細胞之間表面積差別很大

10、；結合這兩個實驗的結果證實，縫隙連接可以介導生長信號的傳遞，協(xié)調細胞之間的生長。構建慢病毒載體感染新生大鼠心肌細胞，發(fā)現蛋白分子 EGFP從感染病毒的細胞擴散至未被病毒感染的細胞，證實大分子物質增強綠色熒光蛋白(EGFP)可以在相互接觸的細胞之間擴散，進一步提供了縫隙連接可以通透大分子物質的證據。
　　【結論】
　　心肌細胞縫隙連接可以通透小于150 kDa的大分子物質，通道孔徑大約為17 nm。因為對大分子物質的通透特性，