細(xì)胞縫隙連接通訊在腫瘤自殺基因“旁觀者效應(yīng)”中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：自殺基因療法克服了病毒介導(dǎo)的基因療法的最大缺陷，即其轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因不能進(jìn)入所有的腫瘤細(xì)胞。通過自殺基因的旁觀者效應(yīng)(bystandeffect)，自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可對(duì)鄰近非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用?，F(xiàn)已證明，幾乎所有的自殺基因系統(tǒng)都具有旁觀者效應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。細(xì)胞間通訊(gapJunctionalIntercellularcommunication，GJIC)可能在旁觀者效應(yīng)中起重要作用，無論是invivo還是invitr

2、o,縫隙連接的表達(dá)高低與潛在的旁殺傷作用之間具有直接的相關(guān)性，特別是在使用單純皰疹胸激酶/更昔洛韋(herpessimplexvirus-thymidinekinase/ganciclovir,HSV-TK/GCV)作為自殺基因系統(tǒng)的情況下更是如此。因此，增加gapjunction的表達(dá)量或轉(zhuǎn)導(dǎo)gapjunction基因，或使用可增加gapjunction功能的代謝化合物(如視黃醛或cAMP)均可提高自殺基因療法的旁殺傷作用。本研究旨在

3、以上理論與實(shí)際的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索以下問題：①HSV-TK/GCV基因系統(tǒng)對(duì)鼠C6細(xì)胞的治療效果，進(jìn)一步驗(yàn)證旁觀者效應(yīng)及其影響因素。②檢測(cè)C6細(xì)胞間縫隙連接通訊及其化學(xué)調(diào)節(jié)變化，并探索其在自殺基因療法中的作用機(jī)制。③進(jìn)一步研究C6細(xì)胞株轉(zhuǎn)染基因前后的生物學(xué)特性。④探索縫隙連接上調(diào)劑或下調(diào)劑對(duì)HSV-/TK/GCV基因治療系統(tǒng)的影響并探索BE在腫瘤自殺基因治療中的形成機(jī)制。通過本研究為膠質(zhì)瘤HSV-TK/GCV基因系統(tǒng)治療提供新的增效方法

4、與手段，為進(jìn)一步提高腦腫瘤的基因治療效果提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：①采用脂質(zhì)體法將pcDNA3-TK質(zhì)粒導(dǎo)入C6細(xì)胞中；②采用劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(scrape-loadingdyetransferassay,SLDT)檢測(cè)不同組別C6細(xì)胞GJIC功能以及GJIC上調(diào)劑(Apigenin)對(duì)其影響；③通過MTT法、流式細(xì)胞儀、TUNEL實(shí)驗(yàn)法及光鏡檢測(cè)GCV/Apigenin對(duì)C6-TK細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)及其作用機(jī)制。結(jié)果：pcDN

5、A3-TK質(zhì)粒構(gòu)建成功并順利導(dǎo)入C6細(xì)胞中；SIDT檢測(cè)表明，C6細(xì)胞間通訊微弱，轉(zhuǎn)染后有部分恢復(fù)，而Apigenin則可明顯增強(qiáng)C6細(xì)胞GJIC功能從而提高C6細(xì)胞間連接通訊。給GCV后轉(zhuǎn)染組(pcDNA3-HSV-TK+)與空載體組(C6-pcDNA3)和對(duì)照組(C6)之間有顯著性差異(p＜0.05)；兩兩比較：轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖水平顯著低于空載體組和對(duì)照組(p＜0.05)；而空載體組的細(xì)胞增殖水平略高于空白對(duì)照組，但這種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義(p＞0.05)；給Apigenin預(yù)處理前：經(jīng)F檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡較空載體組和對(duì)照組間細(xì)胞凋亡水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；Apigenin預(yù)處理后：轉(zhuǎn)染組、空載體組和對(duì)照組中C6細(xì)胞的凋亡水平顯著增高，各組分別與前兩組之間有顯著性差異(p＜0.05)；給GCV+Apigenin后：轉(zhuǎn)染組、空載體組和對(duì)照組中C6細(xì)胞的增殖水平顯著低下，各組分別與前兩組之間有顯著性差異(p＜0.05)，兩兩比較：轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖水平顯著

7、低于空載體組和對(duì)照組(p＜0.05)；③將TK+細(xì)胞與親本(TK-)細(xì)胞分別按10％：90％和5％：95％兩種混合，細(xì)胞培養(yǎng)過夜使其貼壁后予以或不予Apigenin處理，并設(shè)立陰性對(duì)照組。6h后去除Apigenin，分別加入GCV繼續(xù)培養(yǎng)72h后MTT法檢測(cè)殺傷效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)GCV對(duì)GJIC功能有一定的依賴性。TK+細(xì)胞比例為10％的條件下，GCV對(duì)C6-TK+的殺傷效應(yīng)為(79.47±2.96)％：TK+細(xì)胞比例為5％條件下則為(39.4

8、2±1.20)％.(p＜0.01)。未加GCV的混2合細(xì)胞和加入GCV的親本細(xì)胞(TK-)組未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞殺傷效應(yīng)。 相對(duì)未處理組，用10umol/LApigenin預(yù)先處理6h后，GCV對(duì)C6混合細(xì)胞的殺傷效應(yīng)顯著增強(qiáng)(p＜0.01)。結(jié)論：①構(gòu)建的pcDNA3-TK質(zhì)粒能夠在轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞中穩(wěn)定、持續(xù)和高效地表達(dá)；②C6細(xì)胞GJIC功能低下，Apigenin可顯著提高它的GJIC功能并對(duì)C6細(xì)胞的增殖水平有明顯的抑制作用；