γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)與對(duì)tBHP影響的抗氧化酶譜反應(yīng)性研究.pdf

1、腫瘤的放療是一把“雙刃劍”，放射線具有殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，這是放療的主要目的，但是，腫瘤細(xì)胞在接受一定劑量照射后所產(chǎn)生的自由基會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，這種對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用以及對(duì)臨近正常組織細(xì)胞的損傷作用同時(shí)存在，表現(xiàn)為即時(shí)性殺傷與周身延遲性損傷的差異，因此，自由基的殺傷與副作用損傷就構(gòu)成了“同心圓作用”[1]，并與“細(xì)胞旁觀者效應(yīng)”機(jī)制密切相關(guān)，影響整個(gè)放療的進(jìn)程和效果。
　　放射誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)(radiation i

2、nduced bystander effect，RIBE)是指未接受照射的細(xì)胞及旁觀者細(xì)胞受到照射細(xì)胞影響出現(xiàn)諸如細(xì)胞死亡、基因突變、染色體不穩(wěn)定等類似于直接受到照射的細(xì)胞出現(xiàn)的反應(yīng)。旁觀者細(xì)胞與放射細(xì)胞可相鄰，也可不相鄰。其發(fā)生的機(jī)制被認(rèn)為與分泌可溶性擴(kuò)散因子、氧化新陳代謝、細(xì)胞縫隙連接胞間通訊等有關(guān)，氧化新陳代謝是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。過(guò)氧化氫（H2O2）是放療的重要產(chǎn)物，是活性氧（ROS）的重要組成部分，不同劑量的輻射與ROS的產(chǎn)生

3、量呈線性關(guān)系。隨著自由基生物學(xué)研究的發(fā)展，近年的研究發(fā)現(xiàn)：低濃度的自由基，特別是H2O2能夠影響一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。機(jī)體內(nèi)的自由基可以通過(guò)其濃度調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的生死平衡，除了引起細(xì)胞凋亡、壞死的功能，其更廣泛的生理意義在于其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對(duì)細(xì)胞增殖、分化的促進(jìn)；另外臨床觀察不斷有放療后二次腫瘤發(fā)生的報(bào)道，研究者多把關(guān)注點(diǎn)集中在旁觀者效應(yīng)與細(xì)胞表觀遺傳化改變的關(guān)系上，而對(duì)于H2O2充當(dāng)信號(hào)因子并通過(guò)旁觀者效應(yīng)機(jī)制擴(kuò)散在機(jī)體中引起一系列

4、生物學(xué)變化的研究還很少。我們認(rèn)為H2O2在術(shù)后二次腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用。
　　本課題分為實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二兩部分內(nèi)容。“實(shí)驗(yàn)一”主要研究在高劑量的輻射誘導(dǎo)下受照射細(xì)胞通過(guò)旁觀者效應(yīng)對(duì)未接受照射細(xì)胞的損害，實(shí)驗(yàn)表明輻射誘導(dǎo)受照射細(xì)胞產(chǎn)生中、高濃度的ROS通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死?；诖嗽O(shè)計(jì)本課題的實(shí)驗(yàn)二，初步探討了低濃度H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的影響以及與抗氧化酶譜之間的關(guān)系。
　　本課題研究高效抗氧化劑

5、對(duì)旁觀者效應(yīng)的干預(yù)作用，證明高效的抗氧化劑可以改善旁觀者效應(yīng)，此外，低劑量的輻射產(chǎn)生的低濃度H2O2以及外源性低濃度H2O2處理細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞都有促進(jìn)增殖的作用，提示該機(jī)制與臨床放療后二次腫瘤的發(fā)展相關(guān)，不同濃度H2O2對(duì)抗氧化酶譜的影響也不同，主要通過(guò)影響上游Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)抗氧化酶譜的表達(dá)水平，以上結(jié)果對(duì)深入證明氧化新陳代謝機(jī)制以及指導(dǎo)臨床放射治療后的防護(hù)具有重要的意義。
　　1、γ射線照射引起的“旁觀者效應(yīng)”及

6、抗氧化劑的干預(yù)作用
　　分別給予U2OS細(xì)胞0、0.25、1.00、3.00、4.00Gy60Co-γ射線照射，照射后收集細(xì)胞按1×104的密度接種至96孔板，培養(yǎng)48小時(shí)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況結(jié)果顯示：0.25Gy劑量照射細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，與其他各組相比具有顯著性差異（P<0.05），低劑量60Co-γ射線照射后細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）含量與陰性組相比升高，而

7、1.00、3.00、4.00Gy60Co-γ射線照射細(xì)胞后（ROS）含量與陰性組相比升高更為顯著（P<0.05），并有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　基于以上照射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們用3Gy60Co-γ射線照射骨肉瘤U20S細(xì)胞，并將其與未經(jīng)照射的骨肉瘤U20S細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察引起未受照射腫瘤細(xì)胞的RIBE，同時(shí)設(shè)計(jì)了平行的Trolox細(xì)胞培養(yǎng)組，觀察抗氧化劑Trolox的干預(yù)作用。結(jié)果：與陰性組細(xì)胞相比，未受照射細(xì)胞與受照射細(xì)胞共同培養(yǎng)后的

8、細(xì)胞存活率下降（P<0.05），細(xì)胞的活性降低（P<0.05），細(xì)胞克隆集落形成率下降（P<0.05），細(xì)胞微核率含量明顯升高（P<0.05），培養(yǎng)基中的MDA含量明顯增高。經(jīng)過(guò)Trolox干涉后,上述各項(xiàng)指標(biāo)都有明顯的改善。
　　以上結(jié)果表明：骨肉瘤U20S細(xì)胞經(jīng)過(guò)60Co-γ射線照射后引起細(xì)胞明顯損傷、氧化作用明顯增強(qiáng)，而將照射后的細(xì)胞與正常細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察到受照射的腫瘤細(xì)胞對(duì)未受照射細(xì)胞產(chǎn)生“旁觀者細(xì)胞效應(yīng)”，及未受照射細(xì)

9、胞出現(xiàn)同樣的氧化損傷。具有抗氧化作用的維生素E衍生物Trolox對(duì)旁觀者效應(yīng)細(xì)胞的氧化損傷具有顯著的緩解作用。這個(gè)結(jié)果一方面進(jìn)一步證明了ROS是輻射引起旁觀者效應(yīng)的主要活性介質(zhì)，同時(shí)也表明抗氧化劑能夠緩解這種旁觀者效應(yīng)。微核率是反應(yīng)DNA突變的重要指標(biāo)，Trolox對(duì)微核率的改善作用有限提示單一的抗氧化劑存在靶點(diǎn)的局限性。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討旁觀者效應(yīng)的機(jī)制以及利用抗氧化劑緩解臨床放療副作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2、低濃度H2O2對(duì)

10、腫瘤細(xì)胞增殖的影響以及抗氧化酶譜的反應(yīng)性
　　在培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞U2OS中添加外源性H2O2進(jìn)行干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖的影響的對(duì)比研究結(jié)果表明：
　　1）外源性H2O2對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖與凋亡存在劑量依賴性。通過(guò)給予不同濃度外源性tBHP的方式培養(yǎng)細(xì)胞，用MTT法計(jì)算IC50以及測(cè)定細(xì)胞凋亡，用以區(qū)分tBHP對(duì)U2OS細(xì)胞的增殖作用濃度和毒作用濃度，篩選出增殖影響濃度，隨后用tBHP處理細(xì)胞分為0（陰性實(shí)驗(yàn)組）、1.00、10.00、4

11、0.00、100.00μmol·L-1組初步觀察低濃度tBHP對(duì)U2OS細(xì)胞增殖以及凋亡的影響。
　　結(jié)果：?jiǎn)渭兲砑油庠葱詔BHP，1.00、10.00μmol·L-1H2O2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的增殖和生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用（P<0.05），MTT法繪制細(xì)胞增殖曲線顯示這種促進(jìn)作用在加入H2O24小時(shí)后最為明顯，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示1.00、10.00μmol·L-1H2O2不會(huì)促使細(xì)胞的凋亡；而40、100μmol·L-1

12、濃度H2O2對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出毒性作用，表現(xiàn)為40μmol·L-1H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，晚期凋亡細(xì)胞比例明顯增高，凋亡相關(guān)因子Caspase-3與其他組相比表達(dá)增高（P<0.05），100μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，死亡細(xì)胞率顯著性增高（P<0.05）。
　　2）外源性H2O2啟動(dòng)了抗氧化酶譜的應(yīng)激性變化。測(cè)定各個(gè)濃度tBHP處理組細(xì)胞MDA水平的變化以及抗氧化酶的生物活性。利用RT-PCR、Western-Blot等技術(shù)

13、比較系統(tǒng)的觀察調(diào)節(jié)抗氧化酶系的關(guān)鍵因子Nrf2以及抗氧化酶CAT、SOD、GPX的mRNA與蛋白表達(dá)的變化，初步研究低濃度H2O2啟動(dòng)抗氧化酶譜的應(yīng)激性變化。結(jié)果：
　?、?.00、10.00μmol·L-1濃度tBHP組，抗氧化酶的生物活性與陰性組相比表達(dá)降低或變化不顯著；MDA含量低于陰性組，但是，40μmol·L-1組MDA含量與1.00、10.00μmol·L-1組相比，顯著升高（P<0.05）。結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞內(nèi)MDA的形

14、成和抗氧化酶譜的變化，與給與的H2O2劑量具有顯著相關(guān)性，低水平的H2O2（1.00、10.00μmol·L-1以下）沒(méi)有造成細(xì)胞氧化應(yīng)激，當(dāng)H2O2超過(guò)一定濃度后，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的調(diào)節(jié)機(jī)制。低劑量H2O2刺激細(xì)胞，抗氧化酶水平不升高，所顯現(xiàn)的只是信號(hào)因子作用，當(dāng)H2O2水平增加,細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，能夠啟動(dòng)抗氧化酶譜應(yīng)激性表達(dá)，表達(dá)上調(diào)發(fā)揮應(yīng)激損傷的干預(yù)抑制作用。
　　②抗氧化酶基因與蛋白水平的變化。各濃度組的抗氧化酶m

15、RNA水平表達(dá):Cu/Zn-SOD以及GPX1表達(dá)變化明顯，不同濃度H2O2組之間表達(dá)出現(xiàn)明顯差異，蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與mRNA基本一致，40、100μmol·L-1與1.00、10.00μmol·L-1組相比蛋白水平表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　③抗氧化核心上游調(diào)控因子Nrf2的變化。Nrf2被認(rèn)為是抗氧化酶的調(diào)節(jié)因子，Western-blot測(cè)定顯示：1.00、10.00μmol·L-1組與陰性組相比表達(dá)略有下調(diào)，40、100

16、μmol·L-1組表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，其中以100μmol·L-1組最高。
　　以上結(jié)果說(shuō)明低濃度的H2O2（1.00、10.00μmol·L-1）可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮信號(hào)因子的作用，也能被細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)有效清除，隨著H2O2濃度的增高，Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)，抗氧化酶Cu/Zn-SOD以及GPX1的表達(dá)也被調(diào)控性增強(qiáng)，說(shuō)明一定濃度水平的H2O2通過(guò)啟動(dòng)Nrf2上調(diào)表達(dá)而對(duì)下游基因發(fā)揮著調(diào)節(jié)的作用。
　　實(shí)驗(yàn)二以建立細(xì)胞模型

17、為基礎(chǔ)，從外源性添加H2O2處理細(xì)胞并結(jié)合實(shí)驗(yàn)一內(nèi)低劑量輻射可以產(chǎn)生低劑量H2O2的結(jié)果，兩方面探討了低劑量的H2O2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，證明低劑量H2O2可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，外源性低濃度的H2O2可能作為信號(hào)分子參與了細(xì)胞的增殖，且可以被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶清除從而避免細(xì)胞的氧化損傷，而外源性H2O2在高于一定濃度后表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，引起氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞毒作用，并且可能通過(guò)引起Nrf2的表達(dá)增高來(lái)調(diào)節(jié)抗氧化酶譜的表達(dá)，從而激活機(jī)體

18、的抗氧化防御體系。
　　放療過(guò)程中不可避免的會(huì)有H2O2的產(chǎn)生，產(chǎn)生內(nèi)源性的H2O2通過(guò)旁觀者效應(yīng)機(jī)制在非放射線照射的組織和細(xì)胞引起生物學(xué)效應(yīng)，這種效應(yīng)可能是對(duì)正常組織的造成氧化損傷也可能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，發(fā)揮損傷作用為主還是促進(jìn)增殖與H2O2作用細(xì)胞的濃度相關(guān)，H2O2的濃度能夠影響機(jī)體抗氧化酶的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)反饋調(diào)節(jié)Nrf2來(lái)改變下游抗氧化酶的表達(dá)，同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激機(jī)制。本課題的研究的結(jié)果為探討臨床放療后二次腫瘤的