阿霉素及順鉑誘導的早期凋亡A549細胞的免疫原性及其發(fā)生機制.pdf

1、目的:
　　 傳統(tǒng)觀念認為化療藥物對免疫治療有抑制作用,但主要化療藥物如阿霉素等導致腫瘤細胞凋亡或死亡后能否刺激機體免疫細胞,如樹突狀細胞(dendritic cell,DC)等從而啟動機體細胞免疫反應并產生殺傷腫瘤效應,尚需研究。為此,本課題以阿霉素、順鉑誘發(fā)A549細胞凋亡,并以早期凋亡的A549細胞為抗原,體外刺激DC,致敏T細胞,觀察其對培養(yǎng)的A549細胞的殺傷效應,并初步探討其作用機制,為臨床化療聯(lián)合以樹突狀細胞為主的

2、免疫治療新模式的研究和應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)法檢測經阿霉素及順鉑處理后A549細胞的凋亡率。MTT法檢測細胞數(shù)量。DC細胞的制備:采取外周血經密度梯度離心法最終獲得單個核細胞,細胞貼壁培養(yǎng),加細胞因子白介素-4(IL-4),粒-巨細胞集落刺激因子(GM-CSF),培養(yǎng)至第3天和第10天時,以流式細胞儀分別檢測細胞表面CD80、CD83表達情況,以證實是否已成為成熟的DC。

3、以激光共聚焦顯微鏡觀察化療后A549細胞表面鈣網織蛋白暴露情況。
　　 結果:
　　 1mg/L、3mg/L、5mg/L阿霉素與A549細胞孵育12h后,A549細胞凋亡率(％)分別為17.6±1.77,62.93+1.70,16.8+0.65。9mg/L、13mg/L、21mg/L順鉑與A549細胞孵育12h后,A549細胞凋亡率(％)分別為52.99±8.39,62.44±3.41,47.14±8.99。表明阿霉素及

4、順鉑均可誘導A549細胞凋亡,3mg/L阿霉素和13mg/L順鉑處理12h后A549細胞凋亡率較高,且二組相近(P＞0.05),故在后續(xù)試驗中分別以3mg/L阿霉素和13mg/L順鉑來誘導A549細胞凋亡。
　　 以3mg/L阿霉素處理的早期凋亡A549細胞為A組,13mg/L順鉑處理的早期凋亡A549細胞為D組,正常培養(yǎng)的A549細胞為N組(對照組),分別體外刺激培養(yǎng)的DC細胞并致敏T細胞,以MTT法檢測致敏T細胞對A549細

5、胞殺傷力,結果為:A組OD值為0.6245±0.031715,D組OD值為O.8745±0.032569,N組OD值為0.922627±0.041501,A組與其它兩組比較,均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01),說明阿霉素處理的A549細胞具有較強的免疫原性,能誘發(fā)較強的細胞免疫反應從而殺傷更多腫瘤細胞。
　　 分離的外周血單個核細胞在體外經IL-4、GM-CSF等細胞因子刺激后,培養(yǎng)至第3天,以流式細胞儀檢測細胞膜表面相關蛋白,檢測

6、結果CDS0為24.67％;CD83為31.13％。培養(yǎng)至第10天,A組抗原刺激的DC的CD80,CD83分別為81.48％、77.40％;D組抗原刺激的DC的CD80,CD83分別為80.82％,91.61％;N組抗原刺激的DC的CDS0,CD83分別為83.89％、94.71％。上述結果提示,培養(yǎng)10d后DC細胞表面CDS0,CD83表達顯著增加。CD80為共刺激分子,可誘導T細胞的增殖、活化,CD83是樹突狀細胞的特異性標志,參與

7、抗原遞呈和淋巴細胞活化。鏡下形態(tài)觀察:細胞培養(yǎng)初期可見條形、分枝狀細胞,細胞貼壁;培養(yǎng)后期,懸浮的細胞明顯增多,以散在的細胞為主,細胞體積增大,細胞表面可見毛刺狀的突起,呈不規(guī)則的樹突狀。上述細胞表面標記物檢測和細胞形態(tài)學改變說明培養(yǎng)的細胞為樹突狀細胞,且培養(yǎng)至第10天時已處于成熟狀態(tài)。
　　 以免疫學技術和激光共聚焦顯微鏡觀察A549細胞表面鈣網織蛋白表達情況,結果發(fā)現(xiàn)經阿霉素處理的A549細胞表面可見鈣網織蛋白出現(xiàn),順鉑處理

8、的A549細胞及非處理的對照組A549細胞表面未見鈣網織蛋白出現(xiàn)。表明經阿霉素處理的A549細胞表面有鈣網織蛋白暴露,這可能與阿霉素較順鉑能誘發(fā)更強免疫原性有關。進一步將鈣網織蛋白阻斷劑加入阿霉素處理的A549細胞中,在與A組相同條件下,檢測其對A549細胞殺傷效應,結果顯示該組OD值為:0.770727±0.006191,高于A組(0.6245±0.031715),差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),說明以鈣網織蛋白阻斷劑來阻斷細胞膜

9、上暴露的鈣網織蛋白與DC的結合,可降低阿霉素誘導的免疫原性,進一步證實阿霉素引起的A549細胞鈣網織蛋白的暴露是其產生免疫原性的重要原因。
　　 結論:
　　 1、阿霉素及順鉑均可誘導A549細胞早期凋亡,呈非劑量依賴性。2、阿霉素誘導的早期凋亡A549細胞較順鉑誘導的早期凋亡A549細胞有較強的免疫原性。其發(fā)生機制與阿霉素處理的早期凋亡A549細胞細胞膜表面鈣網織蛋白暴露有關。3、本實驗發(fā)現(xiàn)的阿霉素可引起A549細胞鈣