丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制初探.pdf

1、[目的]
　　本課題研究的目的是評(píng)估內(nèi)毒素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)的細(xì)胞毒作用及其可能的分子機(jī)制，同時(shí)觀察丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡保護(hù)作用，并初步從線粒體凋亡途徑揭示其保護(hù)作用的機(jī)理。為丙泊酚在膿毒癥致急性肺損傷的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為急性肺損傷的防治開拓新思路。
　　[方法]
　　不同濃度的內(nèi)毒素體外處理A549細(xì)胞，MTT法測(cè)量?jī)?nèi)毒素在體外對(duì)A

2、549細(xì)胞活性影響的量效和時(shí)效關(guān)系，確定合適的染毒劑量;丙泊酚處理后測(cè)量線粒體膜電位(JC-1作為熒光探針)、ATP酶活性(ATP酶活性檢測(cè)試劑盒)、caspase9酶活性的變化(caspase9酶活性檢測(cè)試劑盒);活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ROS水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率的變化及Ca2+水平;RT-PCR檢測(cè)線粒體順烏頭酸酶(ACO2) mRNA的表達(dá)，用Western-blot技術(shù)檢測(cè)ACO2蛋白的表達(dá)，分析丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素

3、誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的變化及對(duì)線粒體功能的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.在內(nèi)毒素作用0～50μg/ml濃度范圍作用下，A549細(xì)胞的生長(zhǎng)活性隨著內(nèi)毒素濃度的增高而降低，與內(nèi)毒素的濃度呈負(fù)相關(guān)（趨勢(shì)x2檢驗(yàn)，P＜0.05），IC50為10μg/ml。故選用10μg/ml的內(nèi)毒素作用不同時(shí)間，0～24h范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間的增加，A549細(xì)胞的活性降低，與內(nèi)毒素作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(趨勢(shì)x2檢驗(yàn)，P＜0.05)。
　　2.10μg

4、/ml內(nèi)毒素刺激A549細(xì)胞時(shí)用不同濃度的丙泊酚(25uM、50uM、100uM)分別處理，激光共聚焦顯微鏡下JC-1探針觀察到A549細(xì)胞的紅色熒光/綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（q檢驗(yàn)，各組間P＜0.05）。酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase-9酶活性逐漸減弱（q檢驗(yàn)，各組間P＜0.05）而ATP酶活性逐漸增強(qiáng)(q檢驗(yàn)，各組間P＜0.05)。
　　3.DCFH-DA探針經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)丙泊酚抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ROS生成（P＜0.05）;Fluo-

5、3AM探針測(cè)得丙泊酚抑制Ca2+水平增高(P＜0.05);用Annexin-V/FITC探針經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)丙泊酚劑量依賴性地抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，TUNEL法顯示丙泊酚還能抑制DNA斷片形成，阻止晚期凋亡的發(fā)生(P＜0.05)。
　　4.內(nèi)毒素刺激下丙泊酚能夠促進(jìn)線粒體ACO2的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)（x2檢驗(yàn)，P＜0.01）。
　　[結(jié)論]
　　內(nèi)毒素可使肺泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性降低，且該效應(yīng)具有劑