人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、在組織器官(如牙齒、腸、羽毛等)的發(fā)育和再生過程中,上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用具有極為重要的意義.研究表明,位于毛囊底部的特殊間質(zhì)成分——毛乳頭在毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生和毛囊的周期性生長(zhǎng)調(diào)控中起主導(dǎo)作用.毛乳頭細(xì)胞作為毛囊的主要間質(zhì)成分,在毛囊研究中具有相當(dāng)重要的地位.在胚胎發(fā)育過程中,毛乳頭細(xì)胞來源于位于表皮基板下方的一群凝集性生長(zhǎng)的真皮間質(zhì)細(xì)胞.在鼠觸須、鼠體被毛、羊和人皮膚等分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞,培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞在形態(tài)上類似于真皮成纖維

2、細(xì)胞,但一般均表現(xiàn)為凝集性生長(zhǎng)方式,在培養(yǎng)皿中形成相互重疊的細(xì)胞團(tuán),而周圍則形成空隙;真皮成纖維細(xì)胞則表現(xiàn)為平鋪式的融合性生長(zhǎng).在培養(yǎng)情況下,毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)特性將隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多而逐步喪失,一般情況下,第6代以后細(xì)胞不再表現(xiàn)凝集性生長(zhǎng).凝集性生長(zhǎng)是毛乳頭細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一,凝集性生長(zhǎng)與毛乳頭細(xì)胞的功能和分化狀態(tài)有關(guān).但是毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的分子機(jī)制不明,同時(shí)凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞所分泌的蛋白在毛囊發(fā)育和毛囊周期

3、性生長(zhǎng)調(diào)控中的作用也少有研究.毛乳頭是一個(gè)可誘導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu),它能發(fā)送或接受信號(hào),從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長(zhǎng).最近研究發(fā)現(xiàn)了許多在毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)生和周期性生長(zhǎng)中起作用的信號(hào)分子,如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors, FGFs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth fac

4、tor , PDGF)等.這些信號(hào)分子大多來源于毛囊上皮細(xì)胞,它們構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),尚不能確定其中具有關(guān)鍵作用的因子.研究這些因子可能難以從根本上闡明毛囊發(fā)育和周期性生長(zhǎng)的具體機(jī)制,但是我們對(duì)于毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白在其凝集性生長(zhǎng)和毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控中的作用知之甚少,因此有人提出,毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白將是今后毛囊研究的重要內(nèi)容.鑒于以上認(rèn)識(shí),我們認(rèn)為研究毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下所分泌的特異性蛋白有助于闡明毛乳

5、頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)、毛囊發(fā)育及周期性生長(zhǎng)調(diào)控的分子機(jī)制.因此,通過收集凝集性生長(zhǎng)人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)液上清制備成條件培養(yǎng)基,分別作用于傳代培養(yǎng)后失去凝集性生長(zhǎng)特性的毛乳頭細(xì)胞和臨床斑禿患者,用來闡明毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白對(duì)活力較弱毛乳頭細(xì)胞的影響和對(duì)毛囊生長(zhǎng)周期的調(diào)節(jié)作用,以期為臨床治療禿發(fā)性疾病探索一種新的治療途徑.在該研究中,我們首先從人頭皮毛囊分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞,這些細(xì)胞具有周期性凝集性生長(zhǎng)特性,而且這種特性隨著傳代次數(shù)的增多而逐步喪

6、失.凝集性生長(zhǎng)作為毛乳頭細(xì)胞的固有特性與其生物學(xué)功能密切相關(guān).我們收集凝集性生長(zhǎng)人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)液上清制備成條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)9代毛乳頭細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其能將非凝集性生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞轉(zhuǎn)化為凝集性生長(zhǎng)狀態(tài);我們又將條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的9代毛乳頭細(xì)胞與基礎(chǔ)養(yǎng)基培養(yǎng)的9代毛乳頭細(xì)胞分別作細(xì)胞計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基有明顯促進(jìn)高傳代毛乳頭細(xì)胞增殖的能力;我們?cè)賹?代毛乳頭細(xì)胞與9代毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)9代毛乳頭細(xì)胞有向低傳代毛乳頭細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),而2代毛乳頭

7、細(xì)胞未出現(xiàn)向高傳代轉(zhuǎn)化的趨勢(shì).這些結(jié)果表明凝集性生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)等生物學(xué)特性有關(guān).我們應(yīng)用3H-TdR摻入技術(shù),發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞,其3H-TdR摻入值隨著細(xì)胞傳代增高而降低,而對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高傳代毛乳頭細(xì)胞其3H-TdR摻入值是相對(duì)較高的,這表明條件培養(yǎng)基可促進(jìn)活力較弱的高傳代毛乳頭細(xì)胞的增殖;我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù),觀察分泌性蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)狀況,發(fā)現(xiàn)

8、基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞,其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)隨著細(xì)胞傳代增多而降低,而對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高代毛乳頭細(xì)胞其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)是相對(duì)較高的,這表明條件培養(yǎng)基可促進(jìn)活力較弱的毛乳頭細(xì)胞的分泌性蛋白的基因表達(dá);我們?cè)僭陔婄R下觀察條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高代毛乳頭細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞核靠邊,細(xì)胞內(nèi)核糖體較多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌成池,呈圓形和橢圓形,而用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的高傳代毛乳頭細(xì)胞,其電鏡下可見其細(xì)胞核居中,細(xì)胞內(nèi)核糖體較少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌成星

9、形或條索狀,這表明條件培養(yǎng)基可促進(jìn)活力較弱的高傳代毛乳頭細(xì)胞的分泌.這些結(jié)果表明凝集性生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白可促進(jìn)活力較弱高傳代毛乳頭細(xì)胞的增殖和分泌性蛋白的表達(dá)和分泌.我們收集凝集性生長(zhǎng)人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)液上清制備成毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液凍干粉,經(jīng)熱源試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)等檢查無異常,經(jīng)查排除人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體感染,經(jīng)該院倫理委員會(huì)討論同意臨床使用,并征得患者同意且簽署知情

10、同意書的情況下應(yīng)用于斑禿患者.我們發(fā)現(xiàn)在50例毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療的斑禿患者中,除2例無效外其余均有一定療效,這與去炎松治療組比較取得了良好的療效.毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液組、去炎松組和空白組治愈率分別為74﹪、50﹪、10﹪,有效率分別為96﹪、73﹪、30﹪,毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液組其治愈率和總有效率均高于去炎松組和空白組(P<0.05).6月后隨訪,毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液組、去炎松組和空白組治愈率分別為82﹪、58﹪、20﹪,毛乳頭細(xì)

11、胞條件培養(yǎng)液組其治愈率高于去炎松組和空白組(P<0.05).通過以上研究,我們成功地收集了凝集性生長(zhǎng)人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清,制備成條件培養(yǎng)基,將其培養(yǎng)高傳代人毛乳頭細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)能使高傳代人毛乳頭細(xì)胞向低傳代轉(zhuǎn)化,能使高傳代細(xì)胞出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)、3H-TdR摻入值增高、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)水平增高、電鏡下顯示細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)其分泌活力增加;再將條件培養(yǎng)基作用于斑禿患者,發(fā)現(xiàn)有明顯的促進(jìn)斑禿區(qū)頭發(fā)生長(zhǎng)的作用.這些成果為進(jìn)一步深入研究毛乳頭