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文檔簡介
1、目的:觀察不同濃度的表皮生長因子(Epidermal growthfactor,EGF)對毛囊外毛根鞘(out root sheath,ORS)無色素性黑素細胞(amelanotic melanocytes,AMMCs)增殖能力及遷徙能力的影響。
方法:與頭皮提供者溝通獲得同意后。取頭皮并去除脂肪組織及真皮上1mm。采用1%分散酶Ⅱ消化獲得毛囊。再采用0.5%胰蛋白酶消化獲得外毛根鞘細胞。在含有經(jīng)Chelex100鈉形式螯合后
2、的胎牛血清的專用MCDB153培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)。采用差胰酶法傳代純化AMMC細胞。將純化并傳至第三代的細胞,用免疫組織化學(xué)染色法鑒定其NKI/beteb與HMB-45的表達。將經(jīng)過純化和鑒定后的AMMC,根據(jù)EGF的作用濃隨機分為5組:0ng/ml(即空白對照組)、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml濃度EGF干預(yù)組。(1)按照分組條件采用不同濃度EGF干預(yù)AMMC48小時后。采用CCK8檢測法檢測各組細胞的增殖
3、能力。(2)將上述經(jīng)鑒定后的第三代的AMMC,用無血清MCDB153饑餓24 h后,采用Transwell體外小室遷移實驗檢測不同濃度EGF干預(yù)AMMC48小時后各組細胞的遷移能力。所測得的結(jié)果用(x)±s統(tǒng)計,應(yīng)用11.5版本的SPSS統(tǒng)計軟件,行單因素方差分析。確定檢驗水準為P<0.05。
結(jié)果:人毛囊外毛根鞘的無色素性黑素細胞在含有經(jīng)Chelex100鈉形式螯合后的胎牛血清以及各種添加因子的專用MCDB153培養(yǎng)基中可以
4、有效的擴增。通過采用差胰酶法傳代 AMMC細胞可以有效的純化AMMC。AMMC在體外能夠連續(xù)、穩(wěn)定的傳代。傳至第三代的細胞,用免疫組織化學(xué)染色顯示其NKI/beteb染色陽性。HMB-45的染色為陰性。各組CCK8檢測的OD值:空白對照組0.1968±0.1763,1ng/ml EGF干預(yù)組0.2986±0.1773,10ng/ml EGF干預(yù)組0.6302±0.2292,20ng/ml EGF干預(yù)組0.7414±0.2177,50ng
5、/ml EGF干預(yù)組0.8198±0.2604??瞻讓φ战M的OD值低于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組(P均<0.05)。1ng/ml EGF干預(yù)組的OD值低于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組(P均<0.05)??瞻讓φ战M與1ng/ml EGF干預(yù)組的OD值無明顯差異(P>0.05)。10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/m
6、l EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組OD值無明顯差異(P>0.05)。各組Transwell體外小室遷移實驗檢測的遷移細胞數(shù)(個):空白對照組5.88±2.03,1ng/ml EGF干預(yù)組6.75±2.71,10ng/ml EGF干預(yù)組22.50±5.71,20ng/ml EGF干預(yù)組54.75±6.54,50ng/ml EGF干預(yù)組55.75±6.30??瞻讓φ战M的遷移細胞數(shù)少于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml
7、EGF干預(yù)組、50ng/mlEGF干預(yù)組(P均<0.05)。1ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細胞數(shù)少于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組(P均<0.05)。10ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細胞數(shù)少于20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組(P均<0.05)。而20ng/ml EGF干預(yù)組與50ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。
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